UA-Glo Kinase ADP Assay

1. 激酶反应

1) 在96孔或384孔白不透明实验板中进行激酶反应。建议96孔板反应体积为25μL，384孔板反应体积为5μL。可以在激酶反应中加入浓度梯度的测试化合物。

2) 激酶反应的激酶和底物浓度需要根据不同的激酶进行优化。在实验所需的适当信噪比的情况下，可以采用在信号线性反应范围的激酶浓度进行实验。由于UA-Glo ADP激酶检测试剂盒的高度灵敏性，激酶用量可以极大降低。

3) 重要提示：ATP的浓度最高可至1mM。一些市售ATP含有ADP残余，由于UA-Glo ADP激酶检测试剂盒的高度灵敏性，ATP中的ADP残余会导致高实验背景，因此激酶反应需使用高纯度的 ATP，例如Sigma-Aldrich所售 ATP,  Cat# A2383 (纯度≥99%）或其他更高纯度的ATP。

4) 激酶反应可以在通用反应缓冲液中进行(40mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mg/ml BSA, 20mM MgCl2)或采用文献报道的反应缓冲液和辅助因子。

5) 激酶反应的温度和时间需根据不同激酶而设定。进行化合物高通量筛选实验时，建议优化激酶反应于室温(22℃-25℃)进行，以利于在激酶ADP检测，过程中保持实验板的温度均一性。

6) 激酶反应结束后不需要加入额外试剂终止激酶反应。如果因特殊实验要求需要加入激酶反应终止试剂，避免使用镁离子螯合剂，例如EDTA。UA-Glo激酶ADP检测中需要镁离子进行反应。

2. 激酶反应后ATP的去除

1) 取出激酶ATP 去除试剂，平衡至室温(22℃-25℃)。轻摇混匀。

2) 如果激酶反应是在非室温，例如30℃进行反应的，平衡实验板至室温。

3) 加25 µL的ATP去除试剂到 以上25 µL 96-孔实验板中(总体积50µL), 或5 µL ATP去除试剂到5 µL 384- 孔实验板中(总体积10µL)。振荡混匀。 

4) 室温孵育40分钟。

3. 激酶活性测定（ADP检测）

1) 取出激酶ADP检测试剂，平衡至室温。轻摇混匀。（提示： ADP检测试剂中的荧光素酶反应对温度变化敏感。试剂和实验板需要平衡到室温（22℃-25℃），测试过程温度保持恒定（±1℃））

2) 加50 µL的ADP检测试剂到 以上50 µL 96-孔实验板中, 或10 µL ADP检测试剂到以上10 µL 384- 孔实验板中，振荡混匀。室温暗处孵育30分钟。

3) 可以在加入ADP检测试剂后30-60分钟读取荧光信号。由于荧光信号非常稳定，如有需要，可以在加入检测试剂后3小时内读板。