BMDC Differentiation Cytokine Set, Mouse/小鼠BMDC诱导分化细胞因子套装

1. 小鼠骨髓细胞获取
1.1 将6-8周龄小鼠颈椎脱臼法处死，取股骨，去除骨周围的肌肉组织。
1.2 用75%酒精浸泡消毒股骨2分钟，PBS清洗2次。
1.3 用剪刀剪去股骨两端，用注射器抽取PBS，针头从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗直至骨变白。
1.4 收集骨髓悬液，用200目尼龙网过滤。
1.5 滤液1200rpm离心5分钟，弃上清。
1.6 加入2ml 红细胞裂解液，室温裂解3-5分钟。
1.7 加入10ml PBS，1200rpm离心5分钟。
1.8 弃上清，加入PBS清洗1次，用10%FBS的1640培养基重悬细胞。

2. BMDC诱导
2.1 用培养基将细胞密度调整为1e6/mL，同时加入GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，此为D0。
2.2 每2天进行半换液，即取出半量培养基，离心收集悬浮细胞，用等体积的培养基重悬，并补充相应浓度的细胞因子后加入皿中。
2.3 D6收集悬浮细胞和贴壁细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清将细胞密度调整为1e6/mL，同时加入GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，此为不完全成熟的BMDC。
2.4 BMDC的完全成熟：在D8加入TNF-α (20ng/mL)，GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，D10收集悬浮细胞和贴壁生长的细胞。

3.不完全成熟BMDC检测
3.1 收集细胞：细胞因子干预后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹打重悬。
3.2 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，并将按照1e7/mL重悬。
3.3 细胞封闭：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。
3.4 孵育抗体：各加入以下抗体，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。
组1：PE anti-mouse CD11c Antibody (117307) (抗体用量参考说明书）
APC anti-mouse CD80 Antibody (104713) (抗体用量参考说明书）
组2：PE anti-mouse CD11c Antibody (117307) (抗体用量参考说明书）
APC anti-mouse CD86 Antibody (105011) (抗体用量参考说明书）
3.5 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，去除残留的抗体，并再次用PBS重悬。
3.6 死活染料染色：每孔加入7-AAD (559925)，室温避光孵育5min。
3.7 上机检测。

4. 完全成熟BMDC检测
4.1 收集细胞：细胞因子干预后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹打重悬。
4.2 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，并将按照1e7/mL重悬。
4.3 细胞封闭：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。
4.4 孵育抗体：各加入以下抗体，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。
组1：PE anti-mouse CD11c Antibody (117307) (抗体用量参考说明书）
APC anti-mouse CD80 Antibody (104713) (抗体用量参考说明书）
组2：PE anti-mouse CD11c Antibody (117307) (抗体用量参考说明书）
APC anti-mouse CD86 Antibody (105011) (抗体用量参考说明书）
4.5 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，去除残留的抗体，并再次用PBS重悬。
4.6 死活染料染色：每孔加入7-AAD (559925)，室温避光孵育5min。
4.7 上机检测。

store in separate containers to reduce the number of freeze-thaw cycles.