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20世纪90年代前，特异性T细胞检测主要依赖有限稀释法或ELISPOT等功能学方法，通过增殖或细胞因子分泌间接推断细胞数量。这些方法无法获取TCR信息、区分细胞状态，且灵敏度低，难以检测低频（<0.01%）群体。同时，功能检测依赖细胞活性，过程中细胞状态可能改变，无法真实反映体内初始T细胞库。