随着生物制药技术的迅猛发展，抗体-药物偶联物（ADC）作为一种高效且有针对性的药物类型，正逐步在肿瘤治疗中展现出其独特的优势。ADC药物的疗效在很大程度上取决于其内化效率，即抗体能否有效地被靶细胞内化并释放药物。在这一背景下，DT3C重组蛋白作为评价抗体内化效率的重要工具，正受到越来越多研究者的关注。

ADC内化效率检测原理&步骤

原理：

DT3C（Diphtheria Toxin Fragment A and Streptococcus Protein G C1, C2, C3）是一种重组表达的融合蛋白，由白喉毒素的Fragment A（仅毒素部分）和G群链球菌的3C片段（IgG结合部分）融合而成。该蛋白能够与抗体的Fc端高度亲和，与抗体结合的DT3C分子在抗体被内吞时一同进入细胞。DT3C可以与任何IgG型抗体结合，因此可用于检测来自不同物种的抗体内化效率。DT3C与抗体结合后形成的mAb-DT3C偶联物在体外模拟ADC药物的作用机制，有助于在药物研发早期阶段评估抗体的内化能力和药物的释放效率。

DT3C由催化(Cat)、转位(T)和Fc结合(3C)结构域组成。DT3C的Fc结合结构域特异性地与抗体结合。
mAb-DT3C偶联复合物识别并结合细胞表面抗原后，mAb-DT3C-抗原复合物被内化。，其中DT3C的转位末端被细胞弗林蛋白酶切割，DT3C的催化结构域被释放到细胞质中，DT3C释放出具有毒性的DT，DT能够抑制EF2-ADP核糖基化的活性，阻断蛋白翻译过程，最终导致细胞死亡。

未进入细胞的DT3C则不具有杀伤细胞的活性，因此可根据细胞杀伤情况来评价抗体的内化效率

检测步骤：

1、制备mAb-DT3C偶联物：将DT3C蛋白和目的抗体在室温下孵育30分钟，形成mAb-DT3C共轭物。

2、共培养：将mAb-DT3C偶联物直接加到含有抗原阳性细胞（如肿瘤细胞）的完全培养基中进行孵育。

3、检测内化效率：通过MTT, WST-1, CellTiter-Glo,流式细胞术等方法，检测细胞活力或细胞死亡情况，从而评估抗体在细胞表面的内化效率。

DT3C检测ADC药物抗体内化效率优势

广泛适用性：可与来自不同物种（如人、小鼠、兔、山羊）的任何IgG结合。
高效性：在室温下孵育30分钟即可形成mAb-DT3C偶联物。DT3C在细胞内能够迅速释放出具有毒性的DT，从而快速评估抗体的内化效率。
内化效率高：分子量小于Mab-ZAP，mAb-DT3C内化效率高于mAb-Mab-ZAP。
便捷性：通过流式细胞术或荧光显微镜等方法，即可快速、准确地检测mAb在细胞表面的内化效率。

注意事项：在进行体外检测时，应确保实验条件的一致性，如细胞种类、细胞浓度、DT3C和抗体的比例、孵育时间等。需要严格控制实验过程中的无菌操作，以避免外界因素的干扰。

随着生物制药技术的不断发展，ADC药物在肿瘤治疗中的应用前景日益广阔。然而，ADC药物的疗效受多种因素影响，其中抗体的内化效率是关键因素之一。因此，对抗体内化效率的准确评估对于ADC药物的研发具有重要意义。DT3C重组蛋白作为一种高效、简便、广泛适用的评价工具，将在ADC药物研发中发挥越来越重要的作用。未来，随着DT3C技术的不断完善和应用领域的拓展，相信将为ADC药物的研发提供更多有力的支持。

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