人多能干细胞具有无限自我更新和多向分化的潜能，在产生可移植的造血干祖细胞以及各种成熟血细胞如血小板和红细胞方面被寄予厚望。然而，目前的分化方法仅能产生有限数量且功能不完善的血细胞。揭示人多能干细胞造血分化的机理并进而设计高效的血细胞生产策略，是该领域亟需解决的关键科学问题。R-Spondin蛋白家族是一类分泌型糖蛋白，在造血微环境中发挥重要作用。前期研究发现，R-Spondin 2蛋白能够显著提高人多能干细胞造血分化的效率，产生大量的造血干祖细胞。R-Spondin 1(21-146)蛋白作为该家族的重要成员，包含两个富含半胱氨酸的弗林蛋白酶样结构域，保留了与受体结合的关键功能区域，为研究其作用机制提供了重要分子工具。
研究者首先对R-Spondin蛋白的受体及其他G蛋白偶联受体在人多能干细胞造血分化过程中的动态表达进行了系统分析。结果显示，LGR4和LGR5在分化过程中呈现高表达特征。LGR4和LGR5属于富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体家族，是R-Spondin蛋白的高亲和力受体。这一发现提示LGR家族受体可能参与调控人多能干细胞的造血分化过程。通过构建LGR4和LGR5单独敲除或同时敲除的人多能干细胞突变体，并比较其分化潜能，研究者发现仅LGR4敲除影响人多能干细胞的中胚层分化。进一步的动物模型实验证实，LGR4而非LGR5是体内外早期造血发育的重要调控因子，LGR4敲除可显著影响胚胎的中胚层发育。
研究发现，R-Spondin蛋白家族的四个成员在人多能干细胞造血分化过程中的作用和机制存在显著差异。R-Spondin 1、R-Spondin 2和R-Spondin 3均通过促进中胚层细胞产生从而促进造血分化，而R-Spondin 4几乎没有任何造血分化促进作用。在受体依赖性方面，R-Spondin 1和R-Spondin 3依赖LGR4和ZNRF3受体促进人多能干细胞造血分化，而R-Spondin 2则不依赖LGR4和LGR5，可独立通过ZNRF3受体发挥促进作用。ZNRF3是一种E3泛素连接酶，可负向调控WNT信号通路。R-Spondin蛋白通过与ZNRF3相互作用，抑制其对WNT受体的泛素化降解，从而增强WNT信号强度。R-Spondin 1(21-146)蛋白由于保留了弗林蛋白酶样结构域，能够有效与LGR4和ZNRF3结合，发挥调控功能。
机制研究表明，LGR4和R-Spondin蛋白均可通过激活TGF-beta信号通路发挥功能。R-Spondin蛋白与LGR4结合后，与ZNRF3形成复合物，抑制ZNRF3对WNT受体的泛素化降解，从而稳定WNT受体在细胞膜上的表达。这一过程增强了WNT信号通路的强度，进而激活TGF-beta信号通路，促进中胚层细胞的分化和造血干祖细胞的形成。具体而言，活化的TGF-beta信号通路可上调中胚层关键转录因子的表达，包括BRA、MESP1和EOMES等，这些转录因子协同作用驱动中胚层细胞向造血谱系分化。LGR4在信号传导中处于核心位置，其缺失导致信号通路中断，显著影响造血分化效率。
该研究以人多能干细胞和基因敲除动物模型为研究体系，揭示了分泌蛋白R-Spondin家族及LGR受体在中胚层诱导和造血分化过程中的重要功能。研究明确了LGR4而非LGR5是早期造血发育的关键调控因子，阐明了不同R-Spondin家族成员在受体依赖性和作用机制上的差异，证实了TGF-beta信号通路在R-Spondin/LGR4介导的造血分化中的关键作用。这些发现表明R-Spondin蛋白可用作重要工具用于产生大量的血细胞，对提升人多能干细胞造血分化效率并揭示分化机理具有重要价值。在应用层面，将R-Spondin 1(21-146)蛋白添加至分化培养基中，可显著提高造血干祖细胞的产量和质量。
R-Spondin 1(21-146)蛋白作为R-Spondin家族的功能性片段，在造血分化研究中具有广阔的应用潜力。未来研究将进一步探索R-Spondin蛋白与不同受体的结合模式，通过结构生物学手段解析R-Spondin 1(21-146)与LGR4及ZNRF3形成三元复合物的精细结构。基于R-Spondin蛋白的造血分化优化策略，有望为生产临床可用的血细胞提供技术支持，解决血小板和红细胞输注来源短缺的问题。此外，R-Spondin/LGR信号轴在其他组织干细胞分化中的作用也值得深入研究，包括肠道干细胞、肝脏干细胞和骨骼干细胞等。
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