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图1：肠道结构示意图
肠道由内向外分为黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜。
小肠吸收细胞和游离面的细胞膜和细胞质向外突出形成微绒毛。
上皮和固有层向肠腔面形成的凸起称为绒毛(Villus)。
绒毛根部的上皮下陷至固有层，形成管状的小肠腺，又称为隐窝(Crypt of Lieberkuhn)。
绒毛部上皮由吸收细胞、杯状细胞和少量的内分泌细胞组成。
小肠腺除了上述细胞外还有帕内特细胞(潘氏细胞，Paneth)和干细胞。
杯状细胞的主要职责是分泌黏蛋白，随后形成两层-粘液。松散的外层为共生细菌提供了生长条件，维持肠道菌群的平衡。致密的内层牢固粘附在上皮细胞中防止微生物的直接危害。
此外，杯状细胞还会产生一些修复因子促进受伤后的修复过程。
潘氏细胞位于隐窝底部，表达防御素和其他防御肽(如溶酶菌和磷脂酶A2)保持隐窝无菌。
肠道内分泌细胞通过释放多种激素负责协调代谢、胰岛素分泌、食物摄入和营养同化，即使内分泌细胞数量不到肠道细胞的5%。
2009年，Sato等证实在基质胶中体外培养小肠来源的Lgr5阳性干细胞得到了小肠隐窝状结构，命名为“迷你肠”，这是利用Lagr5阳性干细胞形成的最初类器官之一。
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那么小白从实际操作步骤角度来看如何从样本一步步得到类器官？中间有哪些需要注意的步骤，有哪些Trouble Shooting?
组织：来自于人类小肠和结肠生物组织(健康或肿瘤组织，合规)
试剂和培养基：70%(V/V)乙醇、AdvDMEM+++(培养基)、
Primocin(原代细胞抗生素)、胶原酶2、Y-27632 RhoⅡ型激酶抑制剂、BME(基质胶/基底膜)、红细胞裂解液
扩增培养基(Wnt-3a、Rspo-1、Noggin、EGF:50ng/ml)
图2：鼠和人源肠类器官培养基分化条件
耗材：15和50ml离心管、10cm培养皿、一次性手术刀、封口膜、混匀器、摇床、100μm细胞过滤器、5ml移液管、24孔板
操作步骤
一、组织处理
1.组织保存在50ml离心管中，含有25ml AdvDMEM+++和100μg/ml Primocin，4℃保存，直至使用。
2.在生物安全柜中，将工作区除菌，离心管及相关器材用70%乙醇酒精喷拭，风干。
3.新鲜5ml AdvDMEM+++、5mg/ml胶原蛋白酶、10μg Rho在15ml离心管中混匀，冰上保存。
4.将组织转移到10厘米培养皿中，(可将部分组织保存在冷冻瓶或在液氮中快速冷冻用于DNA/RNA分析或组织学分析)。
5.用手术刀将组织切成1立方毫米左右的小块状，添加5ml消化培养基用移液管吹打混匀。
6.转移组织到15毫升离心管中，用培养基冲洗培养皿，保证组织全部进入离心管中。
7.盖上离心管盖子，用封口膜封住，置于摇床上140rpm ，37℃，30-45分钟。(定期检查，当溶液浑浊且没有明显大的块状)
8.采用100μm滤膜过滤细胞，用5ml注射器的推杆帮助细胞通过滤网(大的组织保留在滤膜上)。
9.用5ml AdvDMEM+++冲洗转移滤液至新的离心管中。
10.4℃，450g，离心5分钟，弃上清。
11.10ml AdvDMEM+++冲洗细胞3次，4℃，450g，离心5分钟，弃上清。
12.最后一次将细胞用BME重悬。(根据原始组织的量添加BME，一般30mg左右原始组织需要添加300μl BME，以适当密度接种细胞提高类器官培养建立的效率)。
图3：结肠类器官图
二、细胞铺板和观察生长
1.50μl每孔将细胞重悬液添加在预热的24孔板中，且添加多个15ml的孔。
2.24孔板倒置在37℃，5%CO2细胞培养箱中，20分钟使液滴凝固。
3.小心地在每孔添加500μl扩增培养基和10μM RhoKi。(当建立肿瘤细胞系的时候，可采用Wnt/3A-CM或者Wnt替代物缺乏的培养基，用以筛选不依赖Wnt途径的肿瘤细胞)
4.持续观察类器官生长状态。
三、类器官的分离、传代和扩增
小肠和结肠的分离、传代类似，简言之，将类器官从基底膜基质中回收并机械破碎变成更小的碎片。然后将碎片重悬于新鲜BME中并重新接种。它们将作为新的类器官自我组装，干细胞和转运扩增存在于其中的细胞将继续增殖，产生完全的类器官。
图4：类器官处理步骤
1.去除12-24孔中类器官培养基，用1ml预冷AdvDMEM+++冲洗类器官破坏BME液滴，收集类器官转移到含有4ml预冷AdvDMEM+++的15ml离心管中。
2.4℃，450g，离心5分钟，弃上清。(如果类器官与BME没有完全分离，加入新鲜的BME与类器官混匀后放置于冰上10分钟后再次离心，弃上清)。
3.1ml 预冷AdvDMEM+++重悬，将无菌的10ml移液管尖端连接到巴斯德移液管尖端，将类器官通过开口5-10次，直到没有肉眼可见的块状。
4.用300-400μl BME重悬类器官(避免气泡产生影响类器官生成)。
图5：不同孔板使用BME的体积
5.在预热的12孔培养基中添加100μl悬液，15μl液滴。
6.12孔板倒置在37℃，5%CO2细胞培养箱中，20分钟，使液滴凝固。
7.添加1ml扩增培养基，置于培养箱中继续培养，每2-3天更换培养基并持续观察。
图6：肠类器机械分离和扩增
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1..Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells.
2.Modeling Intestinal Stem Cell Function with Organoids.
营业执照（三证合一） 