照亮细胞的生命之火：发光法细胞活力检测技术详解

在生命科学、药物研发和临床诊断领域，准确、快速地评估细胞活力是至关重要的基础工作。在众多检测方法中，发光法细胞活力检测以其高灵敏度、出色的线性范围和操作简便性，成为了科研与工业界的“金标准”之一。本文将带您深入了解这一技术，看它如何“照亮”细胞的生命活动。

一、 核心原理：ATP——细胞的“能量货币”

发光法细胞活力检测的核心，在于检测一种名为三磷酸腺苷（ATP） 的分子。ATP是细胞内最直接的能量载体，被誉为“能量货币”。一个关键的生物学事实是：只有活细胞才能合成并维持一定水平的ATP；当细胞死亡时，ATP会迅速被降解消失。

基于这一原理，检测技术利用了萤火虫体内的一个经典生化反应：

萤光素酶 + 萤光素 + ATP + O₂ → 氧化萤光素 + AMP + PPi + CO₂ + 光

在这个反应中，ATP是产生光信号的必需底物。产生的光信号强度与样品中ATP的浓度成正比，而ATP的浓度又与样品中活细胞的数量成正比。因此，通过测量光信号的强度，我们就可以精确地反推出活细胞的数目。

二、 标准操作流程

一个典型的发光法细胞活力检测实验（如使用常见的CellTiter-Glo®试剂盒）通常包括以下步骤：

1. 细胞培养与处理： 将细胞接种在培养板（如96孔板）中，待其贴壁或适应后，给予待测药物、化合物或其他处理因素。
   
   

2. 平衡与加样： 将培养板与检测试剂从冰箱中取出，恢复至室温，以确保反应效率稳定。然后，将等体积的检测试剂直接加入到每个含有细胞的培养孔中。
   
   

3. 裂解与孵育： 通过振荡混匀，试剂中的高效裂解成分会迅速破坏细胞膜，释放出细胞内的ATP。同时，反应体系中的萤光素酶等成分与ATP发生反应，产生光信号。通常需要避光孵育10-30分钟，以使信号稳定。
   
   

4. 信号检测： 使用具有发光检测功能的多功能酶标仪读取每个孔的光信号值（RLU，相对光单位）。
   
   

三、 主要优势与特点

与其他细胞活力检测方法（如MTT、CCK-8等吸光度法）相比，发光法具有显著优势：

• 超高灵敏度： 能够检测到极少量的细胞（可低至几个细胞），非常适合低细胞数或微量样本的实验。
  
  

• 宽广的线性范围： 信号强度与活细胞数量在几个数量级内均呈良好的线性关系，使其既能检测细胞增殖，也能检测细胞毒性。
  
  

• 均质检测模式： “加样-混合-检测”一步完成，无需多次洗涤或更换液体，操作简便，易于实现自动化高通量筛选。
  
  

• 无放射性、安全性高： 不同于传统的放射性同位素法，发光法不使用有害物质，对操作者和环境友好。
  
  

• 干扰小： 由于检测的是特异性化学反应产生的光，培养基中酚红的颜色、化合物自身的颜色或轻微浑浊对结果的干扰远小于吸光度法。
  
  

四、 典型应用场景

发光法细胞活力检测技术应用极其广泛：

• 药物筛选与药效评估： 高通量筛选抗癌药物、抗生素或其他细胞毒性化合物的效力。
  
  

• 细胞增殖与毒性分析： 研究生长因子、激素或环境因素对细胞增殖的影响，或评估纳米材料、化学品的细胞毒性。
  
  

• 免疫学研究： 检测CTL（细胞毒性T淋巴细胞）或NK（自然杀伤）细胞对靶细胞的杀伤活性。
  
  

• 生物制品质量控制： 在疫苗生产、细胞治疗等领域，用于监测细胞培养过程中的活细胞密度和存活率。
  
  

• 3D细胞培养模型分析： 其均质检测的特性使其能够有效穿透并裂解小的3D细胞球，提供更准确的整体活力数据。
  
  

五、 注意事项与局限性

尽管功能强大，但在使用该方法时也需注意以下几点：

• ATP水平波动： 细胞的代谢状态、处理因素可能影响其ATP水平，需注意处理时间，避免将代谢抑制误判为细胞死亡。
  
  

• 酶活性影响： 反应依赖于萤光素酶的活性，极端pH、温度或某些化合物可能会抑制酶活，需通过设置对照进行甄别。
  
  

• 信号稳定性： 光信号会随时间衰减，需在规定时间内完成检测，并保持各孔检测时间一致。
  
  

• 仅反映活力，不区分机制： 该方法能告诉你细胞是死是活，但不能解释细胞死亡的机制（如凋亡、坏死等），通常需要与其他检测方法（如Annexin V/PI流式细胞术）联用。
  
  

六、 总结

发光法细胞活力检测，通过巧妙利用自然界中萤火虫发光的原理，将细胞内不可见的“能量流”转化为可定量测量的“光信号”，为我们提供了一把精准、高效的细胞生命状态标尺。随着检测试剂和设备的不断进步，它将继续在生物医学的各个前沿领域扮演不可或缺的角色，照亮科学家们探索生命奥秘与攻克疾病的前行之路。