超越平面，洞察真实：3D细胞活力检测技术

在传统的生命科学和药物研发领域中，绝大多数细胞实验都是在二维的细胞培养皿中进行的。然而，这种单层细胞模型与人体内细胞所处的复杂三维微环境相去甚远，导致实验数据与体内真实反应之间存在巨大差距。为了弥合这一鸿沟，3D细胞活力检测 技术应运而生，它正在成为革新疾病研究、药物筛选和毒理学评估的强大工具。

 

一、3D细胞活力检测是什么？------ 从"铺地毯"到"造器官"的范式转变

 

3D细胞活力检测 是一种用于评估在三维结构中生长的细胞群体存活率、增殖能力和代谢活性的分析方法。

 

传统2D培养：细胞像地毯一样平铺在培养皿表面，所有细胞暴露在相似浓度的养分和药物下，细胞间连接简单，无法模拟组织的天然结构。

 

3D培养：细胞通过特殊方法（如悬浮滴、支架、生物打印等）形成微球或微型组织，称为3D细胞球 或 类器官。在这种结构中，细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间建立了复杂的相互作用，形成了梯度分布的养分、氧气、代谢废物和药物浓度，高度模拟了体内实体瘤或真实组织的微环境。

 

因此，3D细胞活力检测不仅仅是换一种方法数细胞，而是在更接近人体的生理环境下，评估细胞在特定处理（如药物、毒素、辐射）下的功能性反应。

 

二、作用原理------ 如何穿透三维结构看清"内在"

 

对3D细胞球进行活力检测远比2D培养复杂，因为需要穿透结构，区分出外部活细胞和内部可能坏死的细胞。其原理主要基于以下几类技术：

 

1. 代谢活性检测法
这是最常用、最高通量的方法，其原理是测量活细胞中线粒体酶的活性。

 

原理：使用四唑盐类染料（如MTT, CCK-8, WST-1等）。这些染料本身无色或颜色很浅，可穿透细胞膜进入活细胞。在活细胞线粒体内的脱氢酶作用下，它们会被还原成不溶于水（如MTT）或溶于水（如CCK-8）的有色甲臜产物。

 

信号读取：

 

不溶性产物：需要溶解细胞后，用酶标仪测量吸光度。

 

可溶性产物：可直接在培养基中测量吸光度。

 

优势：操作简便，适用于高通量筛选。

 

挑战：染料在3D球体中的渗透可能不均匀，可能导致对核心区域活细胞数量的低估。

 

2. 膜完整性检测法
该原理基于活细胞和死细胞膜完整性的差异。

 

原理：使用双色荧光染料，最常见的是钙黄绿素AM和碘化丙啶。

 

钙黄绿素AM：本身不发光，可穿透细胞膜。进入活细胞后，被胞内酯酶水解生成绿色的钙黄绿素，并被滞留在细胞内，使活细胞发出强绿色荧光。

 

碘化丙啶：不能穿透完整细胞膜，但可以穿过死细胞的破损膜，与细胞核内的DNA/RNA结合，产生强红色荧光。

 

信号读取：使用荧光显微镜、共聚焦显微镜或高通量成像系统进行分析。通过3D成像技术，可以构建Z-stack图像，清晰地展示出3D球体中活细胞（绿色外壳）和死细胞（红色核心）的空间分布。

 

优势：能提供细胞活力空间分布的直观信息，这是2D检测无法实现的。

 

3. ATP含量检测法
ATP是细胞能量的通用货币，其含量与活细胞数量呈高度正相关。

 

原理：裂解细胞后，利用荧光素酶-荧光素系统进行检测。在ATP和氧气存在下，荧光素酶会催化荧光素氧化并发光。

 

信号读取：用化学发光检测仪测量发光强度。发光强度与样品中的ATP含量成正比，从而推算出活细胞数量。

 

优势：灵敏度极高，线性范围广，受药物干扰小，结果非常准确可靠。

 

三、主要用途------ 为何它至关重要？

 

3D细胞活力检测的优越性使其在多个前沿领域成为金标准。

 

1. 抗肿瘤药物筛选与疗效预测

 

模拟实体瘤：3D肿瘤球体具有类似实体瘤的生理特征：外部是增殖活跃的细胞，内部是静息或休眠的细胞，核心区域可能因营养和氧气不足而发生坏死。这种结构对药物的反应与2D培养截然不同。

 

评估药物渗透性：通过成像可以直观看到药物是否能有效渗透到球体核心并杀死内部的癌细胞。许多在2D模型中有效的药物，正是因为无法穿透实体瘤而临床失败。

 

研究肿瘤耐药：3D模型能更好地模拟导致化疗和放疗耐受的微环境因素，为克服耐药性提供新见解。

 

2. 毒理学与安全性评价
在药物开发、化妆品测试和环境毒物评估中，3D细胞模型（如3D肝模型、皮肤模型）能更准确地预测化合物对人体器官的潜在毒性，其结果比2D模型更接近动物实验甚至人体数据，有助于推动"3R"原则（减少、替代、优化动物实验）。

 

3. 干细胞与组织工程研究
在培育用于再生医学的组织工程 constructs（如软骨、骨骼、肝脏组织）时，需要评估细胞在三维支架中的存活、增殖和分化情况。3D活力检测是优化培养条件、确保构建物质量的关键步骤。

 

4. 疾病建模与机制研究
利用患者来源的细胞构建3D类器官，可以高度模拟特定器官（如脑、肠、肺）的生理和病理状态。在这些类器官模型中进行活力检测，可以用于研究疾病发展机制和寻找个性化治疗方案。

 

四、3D 细胞模型构建如何构建？

 

操作步骤：

 

1. 细胞准备
1) 3D 细胞模型构建：根据实验需求进行相关 3D 细胞模型构建，例如 3D 细胞球模型。
2) 如果实验为测定化合物对 3D 细胞模型的作用，将合适浓度的待检测化合物加到细胞板孔中。培养液中有机溶剂浓度保持在 2%以下。根据实验需求继续培养合适的时间。

 

2. 细胞活力检测
1) 取出 3D 细胞活力检测试剂【注1】，平衡至室温（22℃-25℃）【注2】，轻摇混匀。
2)取出待测细胞培养板，平衡至室温（22℃-25℃）。3D 细胞活力检测需要在白色实验板进行检测，如果待测细胞培养板为透明或黑色实验板，需要将 3D 模型转入白色实验板后进行检测。
3)加 50µL 的 3D 细胞活力检测试剂到 100µL 的 96 孔板 3D 模型细胞中, 或 10µL 试剂到 20µL 的384 孔板 3D 模型细胞中【注3】。
4)剧烈振荡实验板 5 分钟以充分裂解细胞【注4】，放置暗处平衡反应 25 分钟。
5)在荧光读板仪上读取荧光信号【注5】。

 

注意事项

 

1) 首次使用试剂后应分装并于-20℃及以下避光储存，保证试剂的稳定性。3D 细胞活力检测试剂反复冻融 5 次信号强度降低<10% 并且功能无损失，放置于室温(22℃)8hr 或 4℃ 72hr 信号强度降低<10% 并且功能无损失。

 

2) 3D 细胞活力检测试剂中的荧光素酶反应对温度变化敏感。试剂和实验板需要平衡到室温（22℃-25℃），测试过程温度保持恒定（±1℃）

 

3) 非经严格验证，不建议随意改变反应试剂用量。细胞培养基和检测试剂的体积比应为 2:1。

 

4) 剧烈振荡实验板以充分裂解细胞是非常必要的，同时要注意实验孔中的液体无溢出。

 

5) 3D 细胞活力检测试剂对不同的细胞类型的 3D 模型信号衰减速度不同，信号半衰期在 1.5h-3h间，建议读板时间不超过 1h-2h。

 

6) 本产品仅作科研用途。

 

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