Caspase 3/7检测试剂盒标准操作指南与结果解析

 

细胞凋亡的精准检测是生命科学研究中的关键环节，而Caspase 3/7的激活是细胞进入不可逆凋亡执行阶段的标志性事件。本指南将详细介绍基于荧光法的Caspase 3/7检测试剂盒的标准操作流程，帮助您获得可靠、可重复的实验数据。

 

一、实验前的准备与实验设计

成功的检测始于周密的实验规划。

1. 细胞准备与铺板

培养板选择：务必使用白色的96孔或384孔细胞培养板。白色板壁能有效反射和增强微弱的荧光信号，提高检测的灵敏度和信噪比，优于透明的普通培养板。

细胞密度：铺植"合适密度"的细胞至关重要。密度过低，信号太弱无法检测；密度过高，则可能导致细胞接触抑制或营养耗竭，产生非特异性背景。需通过预实验优化，通常在96孔板中，每孔接种5,000 - 50,000个细胞（具体因细胞类型而异）。

2. 关键的实验对照设置

一个设计严谨的对照是数据解读的基石。请务必在板上设置以下对照孔：

阴性对照：只加入等量溶剂（如DMSO）的细胞。此组用于确定本底的、未诱导凋亡的Caspase 3/7活性水平。

空白对照：只含培养基，不含细胞的孔。用于扣除培养基本身可能产生的背景荧光信号。

阳性对照（强烈推荐）：使用已知的凋亡诱导剂（如星形孢菌素、Camptothecin等）处理的细胞。此组用于验证您的检测系统和试剂工作正常，并作为信号强度的参考。

 

二、检测步骤详解

请严格按照以下流程操作，以确保结果的一致性。

步骤1：诱导凋亡与孵育

在细胞贴壁并生长至合适状态后，将您待研究的化合物加入对应的孔中。

轻柔混匀：加样后，通过轻微摇动培养板或使用排枪轻柔吹打（避免产生气泡）以确保化合物均匀分布。

根据您的实验设计，将细胞放回培养箱继续培养特定时间以诱导凋亡。这个时间点需要通过预实验确定。

步骤2：试剂与细胞的平衡

在进行检测前，将Caspase 3/7检测试剂和含有细胞的培养板从培养箱中取出，在室温下平衡20分钟。

重要性：此步骤至关重要。冷试剂直接加入37°C的细胞会导致温度冲击，可能影响酶活性并造成冷凝，影响读数准确性。室温反应能获得更稳定的结果。

步骤3：均质化检测------加入检测试剂

按照推荐体积加入检测试剂：

96孔板：在100 µl培养基中加入50 µl检测试剂。

384孔板：在20 µl培养基中加入10 µl检测试剂。

混匀与孵育：

使用平板振荡器振板2分钟，确保试剂与培养基充分混匀。

随后，将培养板置于暗处，室温孵育30-60分钟。

避光：防止荧光物质淬灭。

时间窗口：荧光信号通常在加入试剂后1小时左右达到峰值。您最早可在30分钟时读板，但为了获得最强信号，建议接近60分钟时检测。请勿超过3小时，因为过长的孵育时间可能导致信号衰减或背景升高。

步骤4：信号读取

使用具有化学发光检测功能的酶标仪。根据试剂盒说明书，设置正确的检测参数（通常无需滤光片，或使用宽波段）。

立即进行读数，确保各孔读数的间隔时间一致，以获得可比性数据。

 

三、工作原理回顾与数据分析

1. 原理简述

本试剂盒通常采用能穿透细胞膜的荧光底物（如DEVD肽段连接的荧光基团）。当细胞发生凋亡，活化的Caspase 3/7会特异性切割该底物，释放出荧光基团，从而产生荧光信号。荧光强度与Caspase 3/7的活性成正比，即与凋亡细胞的数量和程度正相关。

2. 数据分析

数据导出：将原始荧光数值（RLU）导出至数据分析软件。

背景扣除：将所有孔的读数减去"空白对照"的平均值。

结果计算：

直接比较：比较不同处理组扣除背景后的荧光强度。

标准化：将处理组的信号与"阴性对照组"的均值进行比较，计算相对荧光强度或凋亡诱导倍数（处理组信号/阴性对照组信号）。

统计分析：使用t检验或ANOVA等统计方法，判断实验组与对照组之间是否存在显著差异。

 

总结

遵循上述标准操作流程，您可以高效、可靠地利用Caspase 3/7检测试剂盒来评估化合物诱导细胞凋亡的效力。严谨的实验设计、规范的操作步骤和合理的数据分析，是揭示细胞生死命运背后分子机制的关键。

 

 

Caspases3/7细胞凋亡检测试剂检测化合物Staurosporine(STSP)对HeLa细胞凋亡的作用：4x105/ml 的HeLa细胞接种于96孔白板透明底培养板，100µl/孔。24小时后加入3倍稀释的STSP，37℃5%CO2孵育6hr后按照Caspases3/7细胞凋亡检测试剂的说明进行Caspases3/7活性检测。图1示加入检测试剂后30min-130min读取荧光值的剂量曲线，表格为计算所得的EC50值。

 

 

Caspases3/7细胞凋亡检测灵敏度测试：1μMSTSP处理HeLa细胞6hr后，两倍系列稀释的STSP处理的HeLa细胞接种于96孔透明底白板，100µl/孔；细胞浓度为25，000-180cell/well。按照Caspases3/7 细胞凋亡检测试剂的说明进行Caspases3/7活性检测。左图示在检测的40min-70min，荧光信号和细胞凋亡数成线性相关（R2>0.99），可以检测低至200个凋亡细胞。右图示1μMSTSP和溶剂DMSO处理HeLa细胞6hr后进行Caspases3/7活性检测(70min荧光检测数值)。