STAT6 His&Strep Tag 重组蛋白：信号转导与转录激活研究的核心工具

本文详细介绍了带有双标签（His & Strep）的重组STAT6蛋白的分子特性、表达纯化系统、在JAK-STAT信号通路研究中的关键应用，以及基于其标签的标准化实验方案，为信号转导与免疫学研究提供高效工具。

STAT6（信号转导与转录激活因子6）是JAK-STAT信号通路中的关键成员，主要在IL-4和IL-13介导的免疫应答中发挥核心作用，调节B细胞增殖、Th2细胞分化及过敏反应等过程。为便于体外研究，重组表达的 STAT6 His&Strep Tag 蛋白 已成为探究其DNA结合、磷酸化调控及蛋白质互作机制的重要工具。

 

一、 分子构建与表达系统特性

典型的商用或自构建重组STAT6蛋白采用双亲和标签策略，以优化纯化与检测效率。

 

核心结构域：

通常包含STAT6的全长或功能性截短体（如包含DNA结合域、SH2结构域和转录激活域）。

 

标签配置：

在蛋白的N端或C端融合串联的 His标签（6xHis） 和 Strep标签 II。

 

His标签：

提供与镍离子（Ni²⁺）或钴离子（Co²⁺）螯合树脂的高效、稳健结合，适用于变性和非变性条件下的初步捕获与纯化。

 

Strep标签 II：

以高亲和力、高特异性结合Strep-Tactin树脂，该结合可被生物素温和竞争性洗脱。该步骤常作为后续的精纯步骤，能获得极高纯度的蛋白，且条件温和，有利于维持STAT6的天然构象与活性。

 

表达系统：

主要在 昆虫细胞-杆状病毒系统（如Sf9细胞） 或 哺乳动物细胞（如HEK293） 中表达。这些系统具备真核细胞的翻译后修饰能力，可确保STAT6发生正确的磷酸化（虽基础水平较低，但为后续激活研究提供理想底物）、二聚化等关键修饰，其功能更接近天然状态。

 

二、 在信号转导研究中的核心应用

带双标签的STAT6重组蛋白为解析JAK-STAT通路机制提供了高度可控的实验材料。

 

体外磷酸化与激酶分析：

纯化的STAT6蛋白可作为底物，与纯化的JAK激酶（如JAK1, JAK3）或含有激活受体的细胞裂解液共孵育，直接研究其磷酸化动力学、位点特异性及抑制剂效果。

 

DNA结合活性分析（EMSA）：

使用双标签纯化的STAT6，经体外激活（磷酸化）后，可用于凝胶迁移或电泳迁移率实验，定量分析其与特定DNA反应元件（如位于靶基因启动子中的GAS或IL-4反应元件）的结合能力与特异性。

 

蛋白质-蛋白质相互作用研究：

 

Pull-down / 亲和纯化：

利用His或Strep标签，将重组STAT6固定化在树脂上，作为"诱饵"从细胞裂解液或蛋白文库中"垂钓"其互作蛋白（如共激活因子、其他转录因子、磷酸酶等）。

 

表面等离子共振（SPR）或生物膜干涉技术（BLI）：

通过标签将STAT6固定在生物传感器芯片上，实时、定量分析其与潜在配体（如磷酸化的受体胞内段、伴侣蛋白）的结合动力学（Kon, Koff, KD值）。

 

结构生物学研究：

高纯度、高均一性的双标签STAT6蛋白是进行X射线晶体学、冷冻电镜分析，以解析其与DNA或互作蛋白复合物三维结构的基础材料。

 

三、 基于双标签的标准化实验流程优势

串联纯化，获得高纯度蛋白： 依次进行固定化金属亲和层析（IMAC） 和 Strep-Tactin亲和层析，可近乎完全去除宿主细胞蛋白、核酸等杂质，满足高灵敏度实验要求。

 

灵活性高：

研究者可根据下游应用选择洗脱方式。如需保持蛋白天然状态，优先使用生物素洗脱Strep标签；如需在变性条件下分析，可使用咪唑（His标签）或低pH缓冲液。

 

检测与固定化便利：

两种标签均有商品化的高灵敏度、高特异性检测抗体（抗-His、抗-Strep），便于Western Blot定量与验证。同时，标签为将蛋白定向固定于各类载体（芯片、微球、酶标板）提供了通用接口。

 

四、 关键研究示例与技术要点

研究STAT6激活机制：

将纯化的野生型与突变型（如DNA结合域突变、SH2结构域突变）STAT6 His&Strep蛋白并行进行体外激酶反应和EMSA，可精确定位功能关键氨基酸残基。

 

筛选小分子抑制剂：

以纯化的STAT6蛋白和JAK激酶建立体外磷酸化检测体系，是筛选能够阻断该特定节点信号通路化合物的有效平台。

 

技术要点：

 

储存与活性：

建议在含有还原剂（如DTT）和甘油的非变性缓冲液中于-80°C分装保存，避免反复冻融。

 

去标签选项： 部分载体在标签与STAT6之间设计有蛋白酶（如TEV、HRV 3C）切割位点，可在纯化后移除标签，用于对标签敏感的研究。

 

结论

STAT6 His&Strep Tag 重组蛋白 通过其精巧的双标签设计，实现了高产率、高纯度的制备，并具备了多功能的应用拓展性。它极大地便利了STAT6在转录调控、细胞信号转导、特别是Th2型免疫应答及相关疾病（如哮喘、过敏）分子机理中的体外生化与结构研究，是免疫学、细胞生物学和药物研发领域研究人员的标准化关键试剂。