GPX4 Flag&His Tag 重组蛋白：铁死亡核心调控因子的关键研究工具

本文系统介绍带有Flag和His双标签的重组GPX4蛋白的分子特征、表达纯化策略、以及在解析铁死亡机制、筛选抑制剂与酶活性测定中的关键应用，为细胞生物学与药物研发领域的研究者提供核心实验材料。

 

一、 概述：GPX4在铁死亡中的核心地位与研究挑战

谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是铁死亡（Ferroptosis）调控网络中的核心抑制蛋白。它通过催化谷胱甘肽（GSH）依赖的脂质氢过氧化物（LOOH）还原反应，从而阻断脂质过氧化的链式反应，维持细胞膜完整性。GPX4功能的丧失是诱导铁死亡的充分条件。研究其酶活调控机制、开发特异性抑制剂或激动剂，对理解癌症、神经退行性疾病及缺血再灌注损伤等病理过程至关重要。然而，GPX4蛋白具有疏水性强、对氧化还原环境敏感等特性，为其体外研究带来挑战。GPX4 Flag&His Tag 重组蛋白 作为一种标准化的纯化与检测工具，为克服这些技术难点提供了有效解决方案。

 

二、 分子构建与表达纯化策略

典型的商用或自构建GPX4重组蛋白采用双亲和标签设计，以实现高效纯化与灵活检测。

 

核心蛋白形式：

通常为人源GPX4的全长序列，分子量约为22 kDa（未计算标签部分）。部分产品也提供主要亚型（如线粒体型）。

 

标签设计：

 

His标签（6xHis）：提供与镍离子（Ni²⁺）或钴离子（Co²⁺）螯合树脂的高效、高载量结合，适用于初始捕获。纯化通常在含有还原剂（如DTT或TCEP）的非变性条件下进行，以维持酶必需的还原状态。

 

Flag标签：位于蛋白的N端或C端，为后续的免疫检测、免疫共沉淀（Co-IP）或亲和纯化提供高特异性的识别位点。

 

表达系统：

主要在 大肠杆菌表达系统 中生产，以实现高产量和低成本。重组蛋白通过变性与复性步骤获得，或在可溶性条件下表达。为获得具有正确折叠和活性的酶，纯化过程中需严格维持还原环境，并可能在纯化后体外补充关键的硒代半胱氨酸（Sec）以恢复完整酶活（部分产品以半胱氨酸替代Sec）。

 

三、 核心应用场景

 

铁死亡机制研究：

 

体外活性验证： 使用纯化的GPX4 Flag&His蛋白，配合GSH和特定底物（如过氧化氢或磷脂氢过氧化物类似物），通过分光光度法或荧光法直接测定其酶动力学参数（Km, Vmax），评估不同氧化还原条件或突变对活性的影响。

 

互作蛋白筛选：利用Flag标签进行免疫共沉淀，将GPX4作为"诱饵"，从细胞裂解液中捕获其潜在的调控蛋白或复合物，以解析其上游调控网络。

 

药物发现与筛选：

直接抑制剂筛选：将纯化的GPX4蛋白作为靶标，建立基于微孔板的体外酶活抑制实验，高通量筛选小分子库中能够直接抑制其活性的化合物（如ML162、RSL3类型的共价抑制剂），并计算IC50值。

 

抑制剂作用机制研究：通过竞争性结合实验、质谱分析或表面等离子共振（SPR）等技术，研究候选药物与GPX4的结合位点、结合化学计量比（利用His标签固定蛋白）及共价修饰位点。

 

结构生物学研究：

高纯度、均一的双标签GPX4蛋白是进行X射线晶体学或冷冻电镜分析，以解析其与底物、抑制剂复合物三维结构的基础材料，可指导基于结构的药物设计。

 

四、 基于双标签的实验方案优势

纯化流程优化： 串联或分步利用固定化金属亲和层析（IMAC） 和抗Flag抗体亲和层析，可获得极高纯度的蛋白，有效去除宿主蛋白和内毒素，满足高灵敏度生化与细胞实验要求。

 

检测与示踪灵活：两种标签均有商业化、高特异性的抗体。抗His抗体常用于Western Blot快速检测表达与纯化；抗Flag抗体则因其极高的特异性，更适用于免疫沉淀、免疫荧光等要求严格的实验。

 

固定化便利：His标签便于将蛋白定向固定于生物传感器芯片（用于SPR/BLI动力学分析）或酶标板，用于分子互作研究。

 

五、 研究注意事项与技术要点

活性维持：GPX4活性严格依赖其活性中心的硒代半胱氨酸和还原态的谷胱甘肽。所有操作缓冲液必须含有足量的还原剂（1-5 mM DTT或TCEP），并避免暴露于氧化环境。

 

储存条件：纯化后的蛋白应在含甘油和还原剂的缓冲液中，于-80°C分装保存，避免反复冻融。

 

对照设计：使用催化位点突变（如Sec→Cys或Ser）的失活型GPX4蛋白作为阴性对照，对于区分药物或条件对酶活的特异性影响至关重要。

 

六、 总结

GPX4 Flag&His Tag 重组蛋白 通过其稳定、高效的双标签系统，成功地将一个在体内容易降解、研究难度高的关键氧化还原酶，转化为可在体外进行精确量化与操作的研究对象。它已成为深入探究铁死亡分子机制的 核心试剂，并直接推动着靶向GPX4的小分子抑制剂（用于诱导癌细胞的铁死亡）或稳定剂（用于神经保护）的药物研发进程。该工具的应用，显著加速了从基础生物学发现到潜在治疗策略转化的研究速度。