未提供的必需品：
具有500nm检测功能的分光光度计或酶标仪。
移液器20-1000µL。
试剂准备
1. 样品 : 在进行分析之前，生物素标记的蛋白质样品必须进行脱盐或透析，以去除所有未反应和水解的生物素偶联剂。
2. HABA-Avidin溶液配制：
1) 将480µL 试剂C磷酸盐缓冲液(PBS)加入试剂B 亲和素的管中，配制5.2mg/mL的亲和素溶液。
2) 请根据所用的测量方法（分光光度法/微孔酶标板法）计算所需的HABA-Avidin混合溶液的体积（分光光度法：900µL/测试；微孔酶标板法：180µL/孔），并按需配制。
3) 配制HABA-Avidin混合溶液：将138µL试剂A HABA溶液与460µL刚配制的亲和素溶液加入到4002µL 试剂C 磷酸盐缓冲液(PBS )中（也可根据需要等比例配制) ，混合均匀，得到HABA-Avidin混合溶液。
4) 该溶液在1cm比色皿中的500nm处的吸光度A500为0.9-1.3；
5) 该混合溶液在4°C下稳定两周。如果在HABA溶液中有沉淀，则可以过滤或离心后再使用；
根据需要选用分光光度法或者微孔酶标板法对标记体系在500nm处的吸光度进行测量
一、分光光度法
1. 在1cm 比色皿中加入 900µL HABA-Avidin溶液，并测量在500nm处吸光度 A1500
2. 向含有HABA-Avidin的比色皿中加入100µL生物素标记的蛋白样品，混合均匀。
3. 检测溶液在500nm处的吸光度，如果该值≥0.3，且数值保持恒定至少15秒钟，记录该值为 A2500。如果该值< 0.3，请稀释生物素标记的蛋白样品并重新测定，但后续计算处理时需考虑样本的稀释倍数。
偶联效率计算
根据朗伯-比尔定律（Beer-Lambert Law）：Aλ = ελbC， 其中：
A ：样品在特定波长(λ)处的吸光度。HABA测定的波长为500nm。
ε：波长(λ)处的吸光系数。对于500nm的HABA-亲和素混合物，pH 7.0时吸光系数为34000M-1cm-1 。
b : 液层厚度或光程长度，单位厘米(cm)。 1cm的比色皿的光程长度为1cm。
C : 样品的摩尔浓度 (mol/L = mmol/mL)。
可得出：
1. 计算蛋白的摩尔浓度：蛋白摩尔浓度（mmol/mL）=蛋白浓度（mg/mL）/ 蛋白摩尔质量（mg/mmol）
2. 计算混合溶液500nm处的吸光度变化 ∆A500 : ∆A500 = 0.9 × A1500-A2500
（注：0.9为校正因子，来自生物素标记蛋白溶液对HABA-Avidin混合液的稀释的调整）
3. 计算生物素摩尔浓度： Biotin（mmol/mL）= ∆A500 / 34000
（注：1cm 比色皿）
4. 计算生物素标记效率：
生物素 ：蛋白（摩尔比）=（生物素摩尔浓度（mmol/mL） × 10）/ （蛋白的摩尔浓度（mmol/mL） × 稀释倍数）
计算示例
若生物素标记的抗体分子量为150,000, 浓度为3.0mg/mL，A1500=1.0，A2500=0.56，
则：蛋白的摩尔浓度：3/150000=2*10-5 mmol/mL
500nm处的吸光度变化：∆A500= 0.9 ╳ 1.0-0.56=0.34
生物素摩尔浓度： 0.34/34000=1*10-5 mmol/mL
生物素：蛋白的摩尔比=1*10-5 ╳ 10 /（2*10-5） =5:1
二、微孔板酶标仪法
1. 在酶标微孔板中加入 180µL HABA-Avidin溶液，并测量在500nm处吸光度（A1500）
2. 向含有HABA-Avidin的孔中加入20µL生物素标记的蛋白样品，混合均匀。
3. 检测溶液在500nm处的吸光度。一旦该值保持恒定至少15秒，记录该值为 A2500。
偶联效率计算
根据朗伯-比尔定律（Beer-Lambert Law）：Aλ = ελbC， 其中：
A ：样品在特定波长(λ)处的吸光度。HABA测定的波长为500nm。
ε：波长(λ)处的吸光系数。对于500nm的HABA-亲和素混合物，pH 7.0时吸光系数为34000M-1cm-1 。
b : 液层厚度或光程长度，单位厘米(cm)。试剂盒中配备的组份D 微孔酶标板 200µL液体时的液层高度约为0.59cm，
C : 样品的摩尔浓度 (mol/L = mmol/mL)。
可得出：
1. 计算蛋白的摩尔浓度:蛋白摩尔浓度（mmol/mL）=蛋白浓度（mg/mL）/ 蛋白摩尔质量（mg/mmol）
2. 计算混合溶液500nm处的吸光度变化 ∆A500： ∆A500 = A1500-A2500
（注：微孔板则不需要校正因子，因为稀释效果正好被孔中溶液增加的高度和光程长度所抵消）
3. 计算生物素摩尔浓度:Biotin（mmol/mL）= ∆A500 /（34000 ╳ 0.59）
（注：试剂盒中配备的96孔酶标板的液面高度/光程长度为0.59cm）
4. 计算生物素标记效率：
生物素：蛋白（摩尔比）=（生物素摩尔浓度（mmol/mL）╳ 10）/（ 蛋白的摩尔浓度（mmol/mL） ╳ 稀释倍数）
计算示例
若生物素标记的抗体分子量为150,000, 浓度为3.0mg/mL，A1500=0.9，A2500=0.56，
则：蛋白的摩尔浓度：3/150000=2*10-5 mmol/mL
500nm处的吸光度变化： ∆A500= 0.9-0.56 = 0.34
生物素摩尔浓度：0.34 /（34000 ╳ 0.59）= 1.7*10-5 mmol/mL
生物素：蛋白 = 1.7*10-5 ╳ 10 /（2*10-5） =8.5 ：1
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