方案1：抗人CD3单克隆抗体固定方法
1. 将NA/LE小鼠抗人CD3单克隆抗体稀释至PBS中，最终浓度为5µg/mL。
2. 将稀释后的NA/LE小鼠抗人CD3单克隆抗体按每孔1mL加入24孔板中固定。
3. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2小时，或在4°C下孵育过夜。
4. 从24孔板中移除NA/LE小鼠抗人CD3单克隆抗体。
5. 准备人外周血单个核细胞（PBMC）的单细胞悬液。对于T细胞激活，细胞应重悬于完全培养基中，浓度为(1-3)×10⁶细胞/mL。对于24孔板，推荐浓度为1×10⁶细胞/mL。
6. 在V型管中准备完全补充的T细胞培养基，向步骤5中的细胞悬液中加入以下细胞因子和抗体：
- 5µg/mL NA/LE小鼠抗人CD28单克隆抗体
- 10ng/mL人白细胞介素-2（IL-2）蛋白
7. 将所需量的细胞转移到合适的细胞培养板中，最终密度为(1-1.5)×10⁶细胞/mL/cm²。
8. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2天。
9. 培养2天后，检查细胞的健康状况并记录图像。
10. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。用PBS洗涤细胞沉淀。
11. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于0.5mL 1%牛血清白蛋白（BSA）中，计数细胞。检测细胞活性，要求活性>95%。
12. 用10µg人IgG抗体阻断1×10⁶细胞。在冰浴中孵育30分钟。
13. 根据说明书加入Brilliant Violet 421™抗人CD25抗体（302630）和Alexa Fluor® 488抗人CD69抗体（310916），在4°C下孵育30分钟。
14. 以400×g离心细胞悬液5分钟，用含1% BSA的PBS洗涤细胞沉淀两次。
15. 将细胞沉淀重悬于200µl PBS中，用于流式细胞术分析（需>10000个细胞）。
方案2：抗人CD3单克隆抗体游离方法
1. 准备人外周血单个核细胞（PBMC）的单细胞悬液。对于T细胞激活，细胞应重悬于完全培养基中，浓度为(1-3)×10⁶细胞/mL。对于24孔板，推荐浓度为1×10⁶细胞/mL。
2. 在V型管中准备完全补充的T细胞培养基，向步骤2中的细胞悬液中加入以下细胞因子和抗体：
- 5µg/mL NA/LE小鼠抗人CD3单克隆抗体
- 5µg/mL NA/LE小鼠抗人CD28单克隆抗体
- 10ng/mL人白细胞介素-2（IL-2）蛋白
3. 将所需量的细胞转移到合适的细胞培养板中，最终密度为(1-1.5)×10⁶细胞/mL/cm²。
4. 在37°C、5% CO₂条件下孵育2天。
5. 培养2天后，检查细胞的健康状况并记录图像。
6. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。用PBS洗涤细胞沉淀。
7. 以400×g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于0.5mL 1%牛血清白蛋白（BSA）中，计数细胞。检测细胞活性，要求活性>95%。
8. 用10µg人IgG抗体阻断1×10⁶细胞。在冰浴中孵育30分钟。
9. 根据说明书加入Brilliant Violet 421™抗人CD25抗体（302630）和Alexa Fluor® 488抗人CD69抗体（310916），在4°C下孵育30分钟。
10. 以400×g离心细胞悬液5分钟，用含1% BSA的PBS洗涤细胞沉淀两次。
11. 将细胞沉淀重悬于200µl PBS中，用于流式细胞术分析（需>10000个细胞）。
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