Colon organoid Cytokine Set, Mouse/小鼠结肠类器官细胞因子套装

完全培养基（扩增）的制备：将基础培养基、细胞因子（1-4）及各类添加物按既定比例混合，配制成完全培养基。

1、原代

（1）在超净台里将鼠结肠组织完整取下，放在预冷的PBS（加青霉素、链霉素、原代抗生素）中,使用灭菌后的剪刀，将肠段沿纵向剪开，然后将其展开，肠腔朝上，用盖玻片刮肠道杂质和残留物，来回两三下，用预冷的PBS冲洗结肠。

（2）用镊子捏着结肠的一端，用剪刀剪成小段，3-5mm左右，收集转移至50ml无菌离心管中，再加入预冷的PBS洗两三遍。

（3）离心管中加入30ml的5mM EDTA/PBS溶液（30mlPBS+300ul 0.5M EDTA）,结肠组织放入离心管中消化， 4℃摇床消化半小时左右，期间经常镜检观察情况，有隐窝脱落为终止消化的信号。

（4）弃去消化液，加入预冷的PBS，轻轻摇晃去除EDTA。

（5）加入30ml预冷PBS含有0.1%的BSA，涡旋震荡让隐窝从结肠上掉下来。

（6）保留上清，过100µm细胞滤网，将过滤后的细胞悬液均匀的分到两个15ml离心管中，1000rpm，离心5min，离心后去上清。

（7）重复步骤5-6，2次，增加获得的隐窝数量。

（8）适量基础培养基或PBS重悬沉淀。

（9）以合适的比例混合基质胶和隐窝，24孔细胞培养板为例，每孔点胶25-30ul基质胶混合物进行铺板。

（10）将铺好的培养板放入37℃培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠结肠类器官完全培养基（恢复室温）进行培养。

2、类器官传代培养

（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃静置20-30min融胶，每3-5孔为一组。1000rpm离心5min弃去液体，保留沉淀。

（3）加1ml类器官消化液到收集的沉淀中，吹打混匀， 37℃消化2-5min。加DMEM/F12基础培养基终止消化，1000rpm离心5min弃去液体，保留沉淀。

（4）添加适量基质胶重悬类器官，每孔25-30ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠结肠类器官完全培养基。

3、类器官冻存

（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，PBS定容到10-14ml，4℃静置20-30min融胶 ，每3-5孔为一组。1000rpm离心5min弃去液体，保留沉淀。

（3）添加适量类器官冻存液，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例，密度为2-3个孔冻存1管，每管体积1ml。

（4）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

4、类器官复苏

（1）取10ml DMEM/F12基础培养基于15ml离心管中。

（2）从液氮罐中取出冻存的类器官，快速置于 37℃水浴锅中融解。

（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min内完全融解。

（4）将溶解后的类器官快速转移至15ml 离心管，使用移液器轻轻吹打6-8次1000rpm 离心 5min，然后除去上清液并收集类器官沉淀。

（5）基质胶重悬，每孔25-30ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠结肠类器官完全培养基。

Avoid vortex oscillation; store in separate portions to reduce the number of freeze-thaw cycles.