Introdution

SPR技术原理

表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，简称SPR)是一种以光学为基础的分析技术。SPR技术利用光发生全反射时消逝波与金属表面等离子波形成共振，导致反射光大幅度减弱。当入射光波长固定时，反射光的强度是入射角的函数，其中反射光强度最低时对应的入射角为共振角(Resonance Angle)。金属表面的介质的折射率非常敏感，当表面介质的属性改变或附着量改变时，共振角将不同。

简单来说SPR就是根据金属表面结合的配体的量或是否结合配体产生不同的共振角，共振角的改变与Ligand-Analyte的数量成正比，以此确定配体与Analyte结合的状态和Ka(热力学亲和常数)。

图1：SPR原理示意图

以上说的金属表面一般是商业化的传感芯片包括：

CM52,CM4,CM3芯片：蛋白、肽段、小分子等。

CM7：小分子化合物；

SA芯片：生物素标记的分子，如核酸、糖类等；

Biotin CAP芯片：可逆性生物素捕获芯片；

NTA芯片：His重组蛋白；

L1芯片：模拟脂质双分子层环境；

HPA芯片：实现膜系统相关的互作分析；

C1芯片：研究细胞、病毒等大颗粒分子；

Au裸金芯片：客户定制表面(材料)高分子等)。

Ligand指配体蛋白，配体蛋白的氨基酸可以与金属表面的葡聚糖结合从而被固定在金属表面。

Analyte指流动相中分子物质。

那么，SPR具体能应用在哪些方向，实际操作中又有什么具体案例呢？

Application

SPR技术应用

特异性分析：目标分子与靶细胞是否结合，特异性如何？

多重结合分析：哪些分子参与了复合物的形成，顺序是什么？

亲和力测定：配体与分析物之间的结合强弱？

动力学分析：两分子结合的速率快慢？

浓度测定：样品中目标分子的浓度高低？

热力学分析：结合强弱、快慢的结构机理是什么？

从以上方向可以看到，SPR技术可以简单理解为判断不同分子相互作用特征的一种技术。不同的分子可以是蛋白-蛋白、蛋白-抗体、小分子-蛋白、小分子-抗体、酶-蛋白等，具体根据SPR的应用方向略有不同，以下是SPR技术在医药领域的应用方向及案例。

案例一：

成熟抗体与非突变始祖先抗体的亲和力比较

本文中，作者将SF5靶向的gp41-MPER多肽(QQEKNEQELLELDKWASLWN)与对照组同序列随机多肽(NKEQDQAEESLQLWEKLNWL)固定在SA芯片上，两种配体通过多肽上生物素与芯片上链霉素连接。成熟抗体2F5与非突变始祖抗体UA1与UA2作为分析物(Analyte)与配体结合。结果表明，2F5与配体的亲和力是UA2的40多倍。

图示2：成熟抗体和非突变始祖抗体亲和力结果

三者的ka和kd分别为

	Ka	kd
2F5	1.97*10⁵M^-1s^-1	8.8*10^-4 s^-1
UA1	3*10⁵M^-1s^-1	3.26*10-2s^-1
UA2	8.4*10³M^-1s^-1	4.1*10^-2 s^-1

案例二：

化合物和多糖的相互作用

黄酮类化合物可在口腔和胃肠道中会抑制淀粉酶的催化活性，阻止食品和消化过程中碳水化合物的水解。作者为了增强淀粉的抗性，控制餐后血糖的升高。首先将淀粉固定在MPA芯片上作为配体，采用3种黄酮溶液(蒙花苷、刺槐素、木犀草素)作为Analyte，三种黄酮溶液的浓度分别在设置为100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L。结果表明(蒙花苷、刺槐素、木犀草树与淀粉作用的K_D的值为(4.822±0.06)、(3.441±0.06)、(2.367±0.25)mmol/L。

与木犀草素相比，蒙花苷、刺槐素C-5’位置少一个羟基，并且C-4’羟基甲氧基化。而蒙花苷、刺槐素结构相似，在A环C-7位羟基被糖苷取代后，分子的大小和极性都增加，结构转移到非平面上，位阻的增大削弱了蒙花苷与淀粉的结合。结合实验数据得到黄酮与淀粉作用的亲和力大小为：木犀草树>刺槐素>蒙花苷。最终得出抑制淀粉水解的能力：木犀草树>刺槐素>蒙花苷。

图3：不同黄酮类物质与淀粉的相互作用结果

案例三：

脂质与小分子(138.1Da-664.8Da)相互作用

本文中，作者想要研究脂质与小分子药物的相互作用，通过L1芯片上的羧甲基化葡萄糖基上共价连接的亲脂性基团将脂质固定在芯片上。采用POPC进行条件优化，DOPA、DOPS、DOPE作为评估脂质的头部基团对分子和脂质相互作用的影响。将DOPC和小分子的反应作为实验组。

首先，作者确认了脂质表面的药物结合能力是否与捕获的脂质体的数量有关，采用单一浓度的药物对9-4330RU的POPC进行实验，结果表明不同脂质捕获数量都有很好的重现性且药物的结合数量与脂质的捕获呈现正相关。

其次，作者分析了脂质的大小是否会影响药物-脂质的相互作用

作者采用0.05、0.1、2μM直径的滤膜分别准备POPC。将三种脂质以900RU捕获在芯片上，用三种不同动力学和亲和力的药物分别与不同脂质结合，结果表明随着脂质直径增大，结合能力略有升高。考虑到制备脂质的难易程度，作者选择100nm直径进行后续实验。

同时作者也通过不同脂质捕获后与小分子药物结合的实验证明脂质的头部基团对药物和脂质的相互作用是有影响的。

最终，作者将结构相关的6个β-blocker化合物与脂质反应，这些化合物都包含一个或多个芳香环和3-氨基-2羟基丙氧基侧链(pKa-9.5)，筛选出4个具有亲和力化合物。

图4：6种化合物示意图及实验结果

图5：筛选出有亲和力的化合物

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