Influenza A virus infection-induced macroautophagy facilitates MHC class II-restricted endogenous presentation of an immunodominant viral epitope

引言

甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）作为全球公共卫生的重大威胁，每年导致数百万感染病例及数十万死亡。其高变异率和跨物种传播能力使得疫苗研发面临持续挑战。传统免疫学理论认为，MHC II类分子主要呈递外源性抗原，而MHC I类分子负责内源性抗原呈递。然而，近年研究表明，病毒可通过自噬（macroautophagy）等机制打破这一界限，实现内源性抗原的跨途径呈递。2021年发表于《FEBS Journal》的研究揭示，IAV感染诱导的自噬过程显著增强MHC II类分子对病毒内源性抗原的呈递，为理解流感病毒感染的免疫应答机制提供了新视角。

研究背景与意义

自噬是细胞通过溶酶体降解自身成分以维持稳态的保守机制。在病毒感染中，自噬既可清除病原体，也可能被病毒利用以促进复制。早期研究显示，自噬可通过调节抗原加工影响MHC I类分子呈递，但其对MHC II类分子途径的作用尚不明确。传统观点认为，MHC II类分子仅呈递外源性抗原，但交叉呈递现象的发现提示内源性抗原也可通过MHC II类分子激活CD4+ T细胞。本研究聚焦IAV感染模型，首次证明自噬是连接病毒内源性抗原与MHC II类分子呈递的关键桥梁，为流感疫苗设计提供了新靶点。

研究内容与方法

1. 病毒模型与细胞系统

研究采用甲型流感病毒A/PR/8/34（H1N1）株感染小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）及人单核细胞来源树突状细胞（moDCs），模拟天然感染过程。树突状细胞作为专业抗原呈递细胞，在启动T细胞免疫应答中起核心作用。

2. 自噬干预手段

• 化学抑制剂：3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬体形成，E64d阻断溶酶体降解。
• 基因敲除：利用CRISPR/Cas9技术构建Beclin1和Atg7基因敲除细胞系，这两个基因分别参与自噬启动和自噬体延伸。

3. 抗原呈递检测技术

• 流式细胞术：使用MHC II类分子（I-Ab）四聚体标记NP311-325特异性CD4+ T细胞，定量分析抗原特异性T细胞活化。
• 共聚焦显微镜：观察自噬体标记蛋白LC3与MHC II类分子 compartment（MIIC）的共定位，验证自噬体与MIIC的融合。
• 蛋白质合成抑制实验：通过放线菌酮（CHX）处理阻断新蛋白合成，明确抗原呈递对新合成抗原的依赖性。

4. 分子机制解析

• 内质网-高尔基体阻断实验：使用布雷菲德菌素A（BFA）抑制蛋白质运输，评估抗原呈递对经典分泌途径的依赖性。
• TAP缺陷模型：利用TAP1敲除细胞分析抗原呈递是否依赖抗原加工相关转运体（TAP），揭示抗原胞质来源。

研究结果

1. IAV感染诱导自噬依赖性抗原呈递

研究证实，IAV感染显著上调BMDCs中LC3-II（自噬体标志物）水平，表明自噬激活。进一步发现，NP311-325特异性CD4+ T细胞的活化在自噬抑制剂或基因敲除细胞中降低约60%-70%，证明自噬是MHC II类分子内源性抗原呈递的关键环节。

2. 抗原呈递依赖新蛋白合成与经典分泌途径

放线菌酮处理使抗原呈递减少85%，布雷菲德菌素A则完全阻断该过程，表明抗原呈递需要新合成的抗原和MHC II类分子，并通过内质网-高尔基体网络运输至MIIC。

3. 自噬体与MIIC融合的直接证据

共聚焦显微镜显示，IAV感染后，LC3标记的自噬体与MIIC的共定位增加3倍，且该过程在自噬抑制剂处理后消失。此外，TAP缺陷细胞中抗原呈递增强，提示部分抗原来源于胞质蛋白，可能通过自噬体直接递送至MIIC。

4. 自噬阻断自噬体-溶酶体融合的机制

IAV感染通过抑制Rab7 GTP酶活性，阻断自噬体与溶酶体的融合，促进自噬体与MIIC的相互作用。这一机制延长了抗原在MIIC中的驻留时间，增强抗原加工效率。

讨论与结论

1. 理论突破：自噬重构MHC II类分子抗原呈递规则

传统理论认为MHC II类分子仅呈递外源性抗原，但本研究表明，IAV感染通过自噬将内源性病毒蛋白（如NP311-325）递送至MIIC，实现内源性抗原的MHC II类分子呈递。这一发现挑战了经典免疫学教条，为理解病毒免疫逃逸和宿主防御提供了新范式。

2. 免疫学意义：增强CD4+ T细胞应答

MHC II类分子呈递的内源性抗原可激活CD4+ T细胞，后者通过分泌细胞因子（如IFN-γ）协调免疫应答。研究显示，自噬缺陷细胞中CD4+ T细胞活化显著降低，提示自噬是流感病毒特异性CD4+ T细胞应答的关键调控因子。

3. 疫苗设计启示：靶向自噬通路

现有流感疫苗主要诱导中和抗体，但对病毒变异株保护有限。本研究提示，通过激活自噬通路增强MHC II类分子内源性抗原呈递，可能开发出更广谱的T细胞诱导疫苗。例如，将病毒抗原与自噬诱导剂联合递送，或设计靶向自噬关键分子（如Beclin1）的佐剂。

4. 未来方向：跨物种比较与临床转化

尽管本研究在小鼠和人类细胞系中验证了机制，但需进一步探索不同流感病毒亚型（如H5N1、H7N9）及蝙蝠源IAV的差异。此外，自噬调节剂的临床安全性需通过动物模型评估，为未来流感治疗提供新策略。

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