破骨细胞体外分化实验全攻略：从原理到实操

 

 

引言  

骨骼并非静止的“钢筋混凝土”，而是一种在一生当中不断“翻新”的动态组织。执行“拆迁”任务的正是破骨细胞（osteoclast）。研究破骨细胞的分化与功能，对于阐明骨质疏松、肿瘤骨转移及骨折延迟愈合的发病机制至关重要。然而，原代破骨细胞难以扩增、寿命极短，因此体外诱导成为主流研究手段。本文将结合最新实验方案，系统梳理破骨细胞的体外分化策略。

 

一、分化原理速读  

1. 细胞来源  

RAW264.7 小鼠单核/巨噬细胞系：表达 M-CSF 及其受体 c-fms，只需外加 RANKL 即可启动分化。  

骨髓单核细胞（BMMs）：需同时补充 M-CSF 与 RANKL。  

 

2. 关键信号轴  

   M-CSF → c-fms（促进前体细胞增殖、诱导 RANK 表达）  

   RANKL → RANK → NFATc1（主转录因子，启动破骨特异性基因：Trap、Ctsk、Dc-stamp 等）  

   OPG 作为“诱饵受体”可阻断 RANKL，负向调控分化。

 

 

二、实验路线选择  

方案	优点	缺点	适用场景
RAW264.7	无需分离动物组织，周期短，重复性好	为永生化细胞，可能丢失部分原代特征	高通量药物筛选、信号通路验证
BMMs	更接近生理状态，可进行基因修饰或共培养	操作复杂，批次差异大	机制研究、微环境互作实验

 

 

三、RAW264.7 快速分化流程（6孔板示例）  

 Step 1细胞培养前期准备

- 选用细胞系：采用RAW 264.7细胞系。

- 配置培养基：使用DMEM高糖培养基，其中添加10%胎牛血清（FBS）以及1%抗生素（例如青霉素 - 链霉素）。

- 设定细胞生长环境：将细胞置于5% CO₂、37℃的培养箱内进行培养。

 

Step 2 细胞接种步骤

- 细胞获取与制备：从RAW 264.7细胞中获取细胞，通过消化法或使用细胞刮刀轻柔刮取细胞，制成细胞悬液。

- 接种细胞：将细胞悬液接种至6孔板中，每孔接种约5 × 10⁵个细胞，确保细胞分布均匀。

- 细胞贴壁培养：让细胞贴壁生长，一般培养过夜，以确保细胞生长状况良好。

 

Step 3 诱导因子添加

- 培养基更换与因子添加：于次日，弃去原有培养基，加入新鲜的含有M-CSF（25ng/mL）、RANKL（100ng/mL）的完全培养基，以此诱导RAW细胞向破骨细胞方向分化。

 

Step 4 细胞培养及分化过程

- 持续培养与观察：继续在含有RANKL的培养基中培养细胞，培养周期通常为5 - 7天。在此期间，每隔2 - 3天更换一次培养基，同时保持RANKL浓度恒定。同时，需观察细胞形态的变化情况。随着时间的推移，细胞会逐渐发生融合，最终形成多核细胞。

 

 

四、BMMs 经典分化流程（24 孔板示例）  

Step 1 骨髓细胞提取  

   ① 取 6–8 周龄 C57BL/6 小鼠股骨、胫骨；  

   ② 1 mL 注射器 PBS 冲洗骨髓腔3 次，收集液体于离心管中，300g 4℃ 离心5 min，弃上清。

(注：避免用力过猛导致细胞机械损伤)；

   ③ 70 μm 筛网过滤，1500 rpm 离心 5 min；红细胞裂解液处理 5 min，PBS 洗涤 2 次。

 

Step 2 BMMs 贴壁筛选  

(1) 细胞重悬与离心：使用5 mL含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基将细胞重悬，离心后去除上清液。

(2) 细胞接种与培养：用5 mL含25 ng/mL M-CSF和10% FBS的α-MEM培养基重悬细胞，转移至6孔细胞培养板（每孔对应一只小鼠细胞），置于37°C、5% CO2培养箱中过夜培养。

(3) 细胞纯化与扩增：收集培养上清液并离心，弃去含有红细胞和粒细胞的上清液，用5 mL含50 ng/mL M-CSF的完全培养基重悬细胞，以5×10⁴个细胞/孔的密度接种至24孔板（每孔1 mL），继续培养2-3天后，贴壁细胞即为骨髓来源的巨噬细胞（BMMs）。

 

Step 3 破骨细胞诱导  

(1) 弃上清液，用无菌 PBS 清洗 2 次。使用含有 50 ng/mL M-CSF 和 50 -100ng/mL RANKL 的完全培养基进行诱导分化；

(2) 细胞每 3 天换一次液，并补加因子 25 ng/mL M-CSF 和 50-100 ng/mL RANKL，4-6 天后进行诱导鉴定。  

 

 

五、破骨细胞“身份认证”  

1. 形态学  

• 相差显微镜：≥3 核巨细胞，边缘可见“皱褶缘”。  
• 鬼笔环肽染色：F-actin 形成“封箱带”。  

 

2. 功能标志物  

• TRAP 染色：胞浆酒红色阳性。  
• 骨吸收实验：羟基磷灰石/牛骨片出现吸收陷窝，可用 SEM 或共聚焦 3D 重建。  

 

3. 分子水平  

   qPCR/WB：Trap、NFATc1、CTSK、DC-STAMP 表达显著上调。

 

 

六、常见问题与解决方案  

现象	可能原因	对策
分化率低	RANKL失效或浓度不足	分装冻存，避免反复冻融；梯度测试 20–100 ng/mL
背景高	血清质量不佳	更换批次或改用已验证的 FBS
细胞脱落	骨片或涂层板处理过度	降低超声功率，缩短清洗时间
过度分化致细胞死亡	成熟破骨细胞寿命本就很短	实验窗口控制在 24 h 内完成检测

 

 

 

1. 诱导培养基现配现用，37 ℃ 预热可减少细胞应激。  
2. RAW264.7 对 RANKL 反应呈“全或无”模式，建议设 0、25、50、100 ng/mL 梯度。  
3. 若研究药物对破骨细胞的影响，最佳给药时间为 Day 0（早期阻断）或 Day 3（后期抑制）。  
4. 如需共培养（如成骨细胞-破骨细胞），可在 Transwell 体系中加入成骨细胞上清或直接接触培养。

 

 

结语  

掌握破骨细胞的体外分化技术，是打开骨代谢研究大门的“金钥匙”。希望本攻略能帮助实验新手少走弯路，也欢迎老手们留言分享更多独家技巧。愿大家的破骨细胞都又大又圆，TRAP 染色红得发紫！

 

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