抗体内化和降解检测技术汇总—助力ADC药物研发

抗体-药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）被誉为“生物导弹”，其核心设计理念是利用抗体的靶向性，将高细胞毒性的小分子药物（Payload）精准递送至肿瘤细胞内部，从而实现高效杀伤并降低全身毒副作用。然而，一款成功的ADC药物，其疗效绝非简单的“抗体”加“毒素”，关键在于连接子（Linker）稳定性和抗体能否被高效内化（Internalization）并在胞内被及时降解（Degradation）以释放Payload。

 

 一、 为何内化与降解检测至关重要？

 

在ADC的作用机制中，内化与降解是承上启下的核心步骤：

1.  内化（Internalization）：ADC与细胞膜表面的靶抗原结合后，通过网格蛋白介导的内吞作用等途径进入细胞，形成内体（Endosome）。
2.  降解（Degradation）：内体逐渐酸化并成熟为溶酶体（Lysosome），在溶酶体内丰富的蛋白酶和酸性环境下，抗体部分被降解，同时裂解型的连接子断开，释放出游离的有效载荷（Payload），进而发挥杀伤作用。

 

 二、 核心检测技术汇总

 

目前，针对内化和降解的检测技术多样，可根据检测原理和目的进行分类应用。

 

1.基于pH敏感染料的内化效率检测

 

 

原理：pH敏感染料在中性pH环境下无荧光，一旦进入酸性胞内环境（pH<6），荧光强度显著增加。将抗体标记pH敏感型试剂后，其荧光强度与内化程度直接相关。

优势：背景信号极低，灵敏度高，特别适合高通量筛选（HTS）。

应用：96或384孔板形式的大规模抗体库初筛。

 

	早期内体到溶酶体		晚期内体和溶酶体
荧光试剂	pH敏感试剂 Green	pH敏感试剂 Red	pH敏感试剂 Deep Red
常用滤光片	FITC	PE	Cy5
激发/发射波长 (nm)	509/533	560/585	640/655
信噪比
光稳定性
亮度
pKa*	6.5	6.5	5
多色标记	是
应用	流式细胞术、荧光显微镜和高通量筛选（HCS）
共定位试剂		EGF-Alexa Fluor 488 （UA011307）	Lysotracker Green DND-20 （UA079025）
即用型 人，小鼠，兔子通用	UA070122	UA070127	UA079026
胺反应性染料			UA079027

 

*信号出现在环境 pH 达到 pKa 之前。

 

验证数据：

 

 

2.基于细胞杀伤的内化效率检测- DT3C重组蛋白

 

 

DT3C是一种重组表达的融合蛋白，与抗体Fc端高度亲和，结合后的DT3C分子在抗体被内吞时一同进入细胞。DT3C释放出具有毒性的DT，阻断蛋白翻译过程，最终导致细胞死亡。

通过MTT, WST-1, UA-Glo细胞活力检测试剂盒(UA070103)等方法，检测细胞活力或细胞死亡情况，从而评估抗体的内化效率。

 

 

 

货号	产品名称
UA070063	DT3C (Diphtheria toxin & spg 3C domain) Protein, Corynephage beta
UA070103	UA-Glo Luminescent Cell Viability Assay/细胞活力检测试剂盒

 

 

3.降解与Payload释放检测技术

 

1）液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）

原理：目前金标准方法。通过高灵敏度的质谱技术，直接定量检测细胞裂解液中释放出的游离小分子Payload及其代谢产物的绝对含量。

优势：灵敏度极高（可达皮摩尔甚至飞摩尔级别），可同时进行定性和定量分析，提供最直接的Payload释放证据。

应用：ADC药效评估、连接子稳定性测试、代谢动力学研究。

 

2）免疫印迹（Western Blot）与免疫沉淀（IP）

原理：利用针对抗体Fc段、独特型（Idiotype）或Payload的特异性抗体，检测细胞裂解液中ADC降解片段或释放的Payload。

优势：可提供降解产物的分子量信息，特异性高。

劣势：半定量，操作繁琐，通量低。

 

3）报告基因法（Reporter Gene Assay）

原理：构建一种工程细胞系，其Payload（如某种毒素）激活的细胞杀伤效应与一种报告基因（如荧光素酶Luciferase）的活性呈负相关。Payload释放越多，细胞活性越低，报告信号越弱。

优势：功能性地反映Payload的整体生物学效应，通量高。

劣势：是间接检测，易受其他因素干扰。

 

相关产品推荐：

抗payload抗体

 

货号	产品名称
S0E0005	Monoclonal Anti-DXD&Exatecan Antibody
S0E0004	Monoclonal Anti-DM-1&DM-4 Antibody
S0E0007	Monoclonal Anti-MMAE&MMAF Antibody
S0E0006	Monoclonal Anti-Eribulin Antibody
S0E0008	Monoclonal Anti-SN38 antibody
S0B0710	Monoclonal Anti-Dxd/Exatecan Antibody

 

部分验证数据：

 

 

 

报告基因检测试剂盒

 

货号	产品名称
UA079013	UA-Glo® Nano-Steady Luciferase Assay System
UA079010	UA-Glo® One-luc Luciferase Assay System
UA070107	UA-Glo® Dual Luciferase Assay System
UA070106	UA-Glo® Renilla Luciferase Assay System
UA070105	UA-Glo® Bright Luciferase Assay System
UA070104	UA-Glo® Steady Luciferase Assay System

 

三、 技术整合与未来展望

 

在实际的ADC研发项目中，通常不会依赖单一技术，而是多种技术联用，相互验证。例如：

   初筛阶段：使用pHrodo或流式细胞术进行高通量内化筛选。

   机制验证：采用共聚焦显微镜观察内化路径和溶酶体共定位。

   终极验证：运用LC-MS/MS金标准方法精确量化Payload的释放量和动力学。

 

抗体的内化与降解是ADC药物发挥“精准杀伤”效应的命门所在。一套成熟、完善且不断创新的内化与降解检测技术体系，如同为ADC研发人员装上了“火眼金睛”，能够穿透细胞膜，洞察内部的运作细节。通过对这些关键过程的深刻理解和精准量化，研究者能够更高效地筛选出最佳候选药物，优化连接子技术，最终加速开发出更安全、更有效的ADC疗法，造福全球癌症患者。