Th1和Th17细胞体外分化操作流程

 

T细胞亚群简介

T细胞亚群

CD4+T细胞可分为Th1、Th2、Th17细胞和调节性T细胞(Treg)。

Th1主要由转录因子STAT4和T-bet调控分化，通过分泌IFN-γ、IL-12和TNF-α等细胞因子，在抗干扰、抗肿瘤等细胞免疫中发挥作用。

Th2主要由转录因子STAT6和GATA3调控分化，通过分泌IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子，主要参与变态反应及抗寄生虫感染，在体液免疫中发挥作用。

Th17是一类特异性分泌IL-17、Rorγt的Th亚群。CD4+T细胞在TGF-β和IL-6联合诱导下分化为Th17细胞。

Treg主要通过分泌抑制性细胞因子(IL-10、TGF-β等)以及细胞接触两种方式，介导免疫调节功能，维护机体免疫平衡。

 

实操介绍

Th1细胞分化

Th1细胞是一类辅助性T细胞，抗原和IL-12介导Th1亚群分化。分化后的Th1主要分泌IFN-γ、TNF，同时也分泌IL-2、IL-2Rα、IL-12Rβ2、IL-18等，Th1型细胞因子与CTL细胞的增殖、分化和成熟有关，促进细胞介导的免疫应答。

1.选择C57BL/6雌性小鼠，颈椎脱臼处死。取小鼠脾脏，将脾脏浸泡在预冷的PBS中。

2.在超净工作台中，用注射器推杆轻轻研磨脾脏，至脾脏没有明显的块状物，来回吹打细胞悬液。

3.加入适量PBS，收集细胞，用过滤器进行过滤。

4.300g离心5min，弃上清，收集细胞再次用适量PBS清洗。

5.采用磁珠分选CD4+T细胞，获得CD4+T细胞后用含有10%的FBS的PRMI1640调整细胞浓度为2*106，96孔板(CD3抗体包被)中每孔加入50μl CD4+T细胞，设3个复孔。

6.每孔加终浓度为2μg/ml CD28抗体，加入终浓度为10ng/ml的IL-12和终浓度为10ng/ml的IL-2，10μg/ml IL-4抗体，用培养基补齐体积至200μl。

7.37℃，5%CO2培养4d。

8.再次刺激细胞，采用流式或上清检测细胞分化和关键细胞因子(IFN-γ,IL-2)含量。

按照以上步骤，将刺激细胞的细胞因子换为IL-4/IFN-γ/IL-12,可诱导T细胞向Th2型细胞分化。

Th17细胞分化

Th17细胞分泌IL-17(IL-17A和IL-17F)、IL-22、IL-23等细胞因子，与自身免疫性疾病和组织炎症密切相关。

一、人外周血淋巴细胞的提取

依据人淋巴细胞分离液的说明书，通过密度梯度离心分离人外周血淋巴细胞：

1.在15ml离心管中加入人淋巴细胞分离液3ml，置于室温。

2.倾斜离心管缓慢加入新鲜血液3ml于淋巴细胞分离液上层，保持界面清晰。

3.2000r/min室温离心30min，离心后上层为血浆，中层为人淋巴细胞分离液，上层和中间界面乳白色云雾状条带为富含淋巴细胞和单核细胞的部分(PBMC)，下层为红细胞和粒细胞。

4.小心取出PBMC转移至新的离心管中，生理盐水洗涤2次，1000r/min，离心10分钟，弃上清。培养基重悬计数，待用。

二、添加细胞因子及抗体诱导细胞分化

1.以每孔1*106细胞密度，将细胞加入hCD3抗体包被的孔板中。

2.加入hCD28抗体(1μg/ml)，hIL-1β(10ng/ml)，hIL-6(10ng/ml)，hTGF-β(1ng/ml)，hIL-23(10ng/ml)。

3.37℃，5%CO2培养箱3d，诱导人Th 17细胞体外分化。

三、培养3d后，流式检测。

1.在流式染色前4~6h，每孔加人20ng/ml PMA，1μg/ml离子霉素以及1μl/ml GolgiStop。1000r/min离心5min，收集上清液和细胞沉淀，上清液置于-20℃保存备用。

2.染色缓存液1ml重悬细胞沉淀，1000r/min离心5 min。弃去上清液,加入anti-CD16/CD32抗体的工作液100ul重悬细胞沉淀，4℃孵育20min。

3.用染色缓存液洗涤细胞1次，加入CD4荧光标记抗体的工作液100μl重悬细胞沉淀4℃暗处孵育30min。

染色缓存液洗涤细胞1次，加入缓冲液250μl重悬细胞沉淀，4℃暗处孵育20min。

4.Perm/Wash缓冲液洗涤细胞2次，加人胞内荧光标记抗体(IL-17A抗体)的工作液50μl重悬细胞沉淀，4℃暗处孵育30mino Perm/Wash缓冲液洗涤2次，染色缓存液500μl重悬细胞沉淀,上机检测。分析CD4+IL-17A+在CD4+T细胞中所占的百分数。

 

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