巨噬细胞/DC细胞/NK细胞-培养操作详解

 

单核-巨噬细胞系统包括血液中的单核细胞和组织中固定或游走的巨噬细胞，具有吞噬功能。单核细胞来源于骨髓干细胞，在骨髓中经前单核细胞分化发育为单核细胞，然后由骨髓释放入血，经过血液循环经过各个组织，分化成组织中的巨噬细胞。

树突状细胞(Dendritic Cell，DC)因成熟时有许多树突状或伪足样凸起而命名。是目前发现的最强的抗原递呈细胞(Antigen presenting Cell,APC)。已经证实DC是唯一能够显著刺激初始T细胞增殖的APC。

NK(Natural Killer)细胞主要来源于骨髓，在骨髓微环境中逐渐发育成熟分布至外周血中。当病毒感染细胞、寄生虫入侵等感染因素发生及自身细胞衰老、恶变时，NK细胞可以识别异常细胞，并通过穿孔素/颗粒酶途径并直接裂解异常细胞或通过Fas-FasL、激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用。

下面让我们来看下这三种细胞的培养方法吧，GO，GO，GO!

 

巨噬细胞

实验材料和仪器

试剂：75%乙醇、RPMI-1640培养基、M-CSF、Gomori酸性磷酸酶、CD14-FITC和IgG2-FITC等。

仪器及耗材：注射器、小鼠解剖台、离心机、离心管、流式细胞仪、细胞计数仪等。

操作步骤

1. 颈椎脱臼处理6只C57BL/6小鼠，75%酒精浸泡消毒5分钟。无菌手术取出股骨，尽量去除周围肌肉组织，以PBS洗涤2次，不完全1640培养基清洗1次，移入置于冰上的无菌培养皿内。

2. 镊子固定长骨，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取PBS，反复冲出骨髓至培养皿中，直至骨髓变成白色。

3. 收集冲洗液体，用70μm细胞筛获取单细胞悬液。滤液以1500rpm离心5mins，弃上清。

4. 加入10ml氯化铵红细胞裂解液，室温孵育2-3分钟，1100rpm离心5mins弃上清。

5. 将细胞用含有M-CSF(10ng/ml)的RPMI1640培养基重悬，调整密度至2*106个/ml，铺在培养皿中。

6. 37℃、5%CO2培养箱中培养。

7. 每天观察细胞状态，根据培养基颜色更换新鲜培养基。

8. 培养至6-8天，几乎所有贴壁细胞都是巨噬细胞(此为M0期)。

巨噬细胞的极化需要将M0期细胞收集后，重新铺板加入M1或M2极化刺激细胞因子，详情如下：

 

	M1	M2
刺激因子	LPS(2000ng/ml)+IFN-γ (2.5ng/ml)	IL-4(10ng/ml)或IL-13(10ng/ml)
特征标志分子	iNOS、TNF-α、CD86	IL-10、Arg-1、 CD206
表型特征	促炎，Th1细胞应答，抵抗病原体入侵	抗炎、组织修复、免疫调节、 Th2细胞应答

 

细胞检测

1. 透射电镜观察

2. 用Gomori酸性磷酸酶(ACP)法染色，计算巨噬细胞阳性率。

3. 细胞吞噬功能检测：

取适量巨噬细胞悬液放入培养瓶中，加入1%鸡红细胞悬液，37℃孵育2h，甲醇固定细胞涂片，吉姆萨染色，显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞。计数吞噬率和吞噬指数。

吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100*100%

吞噬指数=100个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数/100

4. 流式细胞检测：

CD14-FITC和IgG2-FITC检测巨噬细胞表面CD14的表达量。

M1和M2分别检测TNF-α、CD86、CD11c、CD206等标志表达蛋白。

 

树突状细胞

实验材料和仪器

试剂：70%乙醇、RPMI-1640培养基、1*PBS、氯化铵、GM-CSF、IL-4、FITC-anti-mouseCD11c、PE-anti-mouseCD40、FITC-anti-mouseCD80、PE-anti-mouseCD86、FITC-anti-mouse MHCⅡ及同种型对照抗体FITC-Rat IgG2b、PE-Rat IgG2a、IL-12p70、IFN-r和IL-4等。

仪器及耗材：注射器、小鼠解剖台、离心机、离心管、流式细胞、200目尼龙布、细胞培养皿、细胞计数仪等。

操作步骤

1. 颈椎脱臼6只C57BL/6小鼠，70%酒精浸泡消毒5分钟。无菌手术取出股骨和胫骨，尽量去除周围肌肉组织，以PBS洗涤2次，不完全1640培养基清洗1次，移入置于冰上的无菌培养皿内。

2. 镊子固定长骨，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取不完全1640培养基，针头分别从两端插入骨髓腔，反复冲出骨髓至培养皿中，直至骨髓变成白色。

3. 收集冲洗培养基，用200目尼龙网过滤去除肌肉组织和骨头碎片。滤液以1000rpm离心5mins，弃上清。

4. 加入10ml氯化铵红细胞裂解液，室温孵育2-3分钟，1100rpm离心5mins弃上清。

5. 不完全1640培养基洗涤2次，用5ml完全培养基重悬细胞后接种于培养皿中。

6. 37℃、5%CO2培养箱中孵育3小时吸出悬浮和半贴壁细胞，1000rpm离心5mins弃上清。

7. 用10%FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，计数后调整细胞密度为6*105个/ml，铺至24孔板中培养。同时加入鼠源GM-CSF(20ng/ml)和IL-4(10ng/ml)。

8. 37℃、5%CO2培养，此为第0天。

9. 在培养的第2天，轻轻震荡培养板，吸弃1/2-2/3旧培养基(去除粒细胞)，补充新鲜培养基，每两天半数换液一次。并补充细胞因子。

10. 培养至第7天，轻柔吹打培养基，收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞，即为未成熟DC细胞。

11. 室温下，1000rpm离心10mins，弃上清。用培养基重悬，计数后调整密度至1*106个/ml，加入24孔板培养板中，分别补充脂多糖(LPS,1μg/ml)、TNF-α(250U/ml)或CD40L(1μg/ml)，继续培养48h后，收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。同时收集上清，冻存于-70℃冰箱中待检测IL-12p70。

细胞检测

1. 光镜观察+电镜观察

2. DC表面分子标志的检测：

采用FITC-anti-mouseCD11c，PE-anti-mouseCD40, FITC-anti-mouseCD80，PE-anti-mouseCD86, FITC-anti-mouse MHCⅡ及同种型对照抗体FITC-Rat IgG2b和PE-Rat IgG2a，4℃避光孵育30mins，staining buffer洗涤3次后用流式细胞仪检测。

3. 同种混合淋巴反应：

将成熟和未成熟DC细胞与CD4+T细胞同培养72小时后，终止培养前16小时加入3H-TdR。后将细胞收集至49型纤维膜上，加入闪烁液，检测cpm数值。

4. ELISA检测细胞因子：

捕获抗体包被96孔板，将IL-12p70、IFN-r和IL-4标准品作为对照。将培养上清分别加入检测孔中，检测DC细胞分泌IL-12p70、IFN-r和IL-4的浓度。

 

自然杀伤细胞

实验材料和仪器

试剂：重组人源IL-2、重组人源IL-15、PRMI1640培养基、CD3-FITC、CD45PerCP、CD56-PE、Ficoll、1*PBS

仪器：OLYMPUS显微镜、流式细胞仪、CO2细胞培养箱、生物安全柜、离心机、超纯水仪、恒温水浴锅等。

操作步骤

1. 在超净工作台中，将15ml的PBMC样品置于置物架上，按照1：1小心加入生理盐水稀释。

2. 在超净工作台中，将30ml的PBMC样品置于置物架上，按照2：1的比例加入淋巴分离液(Ficoll)。

3. 2000r/min，离心20分钟。

4. 离心结束将最上层血浆小心取出放置于新的50ml离心管中标记血浆；将间白色细胞层小心取出存放于新的离心管标记细胞。

5. 存放血浆的离心管置于56℃水浴锅中30min后取出。

6. 再次3000rpm离心15min，取上清于新的离心管。

7. 在存放白色细胞层离心管中加入适量1*PBS，2100rpm，离心6min。

8. 弃上清后再次加入适量1*PBS，1500rpm，离心6min，弃上清。

9. 细胞计数后，按照1-2*106cell/ml的密度接种至4℃存放CD16抗体包被后的T75培养瓶中。培养基中已加入10%热灭活自体血浆，1000U/ml IL-2、50ng/ml的IL-15。

10. 将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

11. 第2天：显微镜下观察细胞生长状态，无异常情况且细胞生长良好。

12. 第3天：显微镜下观察细胞生长状态，无异常情况且细胞生长良好。补加培养基，同步补充10%热灭活自体血浆、1000U/ml IL-2、50ng/ml的IL-15。

13. 第5天：镜下观察细胞有较大集落，补充培养基、血浆、细胞因子。

14. 第7天：细胞计数，若细胞超过2*108cell/ml，则需要转移至培养袋中培养。

15. 第8到10天：在细胞数量达到要求后，收集细胞进行检测。

细胞检测

1. 台盼蓝检测：

活细胞占比>90%；

2. 细胞流式检测：

收集培养7天和10天的细胞，将细胞浓度调整至1*107cell/ml，标记荧光抗体CD3-FITC、CD45PerCP、CD56-PE，各组设置同型阴性对照。4℃避光孵育30分钟后，PBS清洗2次，进行流式检测。

3. 细胞杀伤实验：

去培养10天的细胞，收集NK细胞计数，使用CFSE标记缓冲液清洗1次并重悬细胞(细胞密度为1*107cell/ml，CFSE终浓度为200nmol)，置于37℃培养箱孵育15min。PBS清洗2次，用NK细胞培养基重悬细胞。6孔板中加入0.5mlK562细胞(1*105 cell/孔),然后按照比例(5:1、10:1、20:1)加入标记好的NK细胞，同时设置NK细胞和K562细胞的对照组。共培养4h。

收集共培养细胞用7-AAD法检测K562细胞的死亡率。

 

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