小鼠结肠类器官与细胞因子：构建体外微结肠的分子蓝图

小鼠结肠类器官作为一种革命性的体外模型，其成功构建与长期维持完全依赖于特定细胞因子组合所提供的精确信号调控。这些因子共同模拟了体内结肠干细胞微环境的分子特征，使类器官能够重现结肠上皮的结构与功能。

 

第一部分：核心生长因子的基础支撑作用

 

表皮生长因子（EGF）

EGF是结肠类器官培养中最基础的有丝分裂原。它通过激活EGFR信号通路，为结肠上皮细胞提供持续的增殖信号，保证类器官的稳定扩增。研究表明，撤除EGF会导致类器官生长停滞，证实其在维持基础细胞分裂中的不可或缺性。

 

成纤维细胞生长因子（FGF）

特定FGF家族成员（如FGF2和FGF10）在结肠类器官培养中发挥重要调节作用。它们不仅增强干细胞的自我更新能力，还参与调控结肠上皮细胞的极性建立和隐窝样结构的形态发生，对维持类器官的长期培养稳定性至关重要。

 

第二部分：关键信号通路的精密调控网络

 

Wnt/β-catenin信号通路

Wnt信号是维持结肠干细胞干性的核心因子。在类器官培养中，Wnt3a和R-spondin的组合能够强力激活β-catenin信号，促进干细胞增殖并抑制其过早分化。值得注意的是，结肠类器官对Wnt信号的依赖性极高，这与结肠癌中Wnt通路异常激活的病理特征高度相关。

 

BMP信号通路

与小肠类器官相似，结肠类器官的培养需要抑制BMP信号。通过添加Noggin等BMP抑制剂，可以在体外重现体内结肠隐窝基底部的低BMP微环境，这对于维持干细胞功能和促进类器官出芽生长至关重要。

 

Notch信号通路

Notch信号在决定结肠上皮细胞命运中起关键作用。高Notch活性促进吸收性细胞的分化，而抑制Notch信号则导致分泌性细胞（如杯状细胞）的比例增加。这种精细的平衡调控使得研究人员能够通过调节Notch信号来操纵类器官的细胞组成。

 

第三部分：关键信号通路的精密调控网络

 

完全培养基（扩增）的制备：将基础培养基、细胞因子（1-4）及各类添加物按既定比例混合，配制成完全培养基。

 

1、原代

 

（1）在超净台里将鼠结肠组织完整取下，放在预冷的PBS（加青霉素、链霉素、原代抗生素）中,使用灭菌后的剪刀，将肠段沿纵向剪开，然后将其展开，肠腔朝上，用盖玻片刮肠道杂质和残留物，来回两三下，用预冷的PBS冲洗结肠。

 

（2）用镊子捏着结肠的一端，用剪刀剪成小段，3-5mm左右，收集转移至50ml无菌离心管中，再加入预冷的PBS洗两三遍。

 

（3）离心管中加入30ml的5mM EDTA/PBS溶液（30mlPBS+300ul 0.5M EDTA）,结肠组织放入离心管中消化， 4℃摇床消化半小时左右，期间经常镜检观察情况，有隐窝脱落为终止消化的信号。

 

（4）弃去消化液，加入预冷的PBS，轻轻摇晃去除EDTA。

 

（5）加入30ml预冷PBS含有0.1%的BSA，涡旋震荡让隐窝从结肠上掉下来。

 

（6）保留上清，过100µm细胞滤网，将过滤后的细胞悬液均匀的分到两个15ml离心管中，1000rpm，离心5min，离心后去上清。

 

（7）重复步骤5-6，2次，增加获得的隐窝数量。

 

（8）适量基础培养基或PBS重悬沉淀。

 

（9）以合适的比例混合基质胶和隐窝，24孔细胞培养板为例，每孔点胶25-30ul基质胶混合物进行铺板。

 

（10）将铺好的培养板放入37℃培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠结肠类器官完全培养基（恢复室温）进行培养。

 

2、类器官传代培养

 

（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

 

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃静置20-30min融胶，每3-5孔为一组。1000rpm离心5min弃去液体，保留沉淀。

 

（3）加1ml类器官消化液到收集的沉淀中，吹打混匀， 37℃消化2-5min。加DMEM/F12基础培养基终止消化，1000rpm离心5min弃去液体，保留沉淀。

 

（4）添加适量基质胶重悬类器官，每孔25-30ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠结肠类器官完全培养基。

 

3、类器官冻存

 

（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

 

（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，PBS定容到10-14ml，4℃静置20-30min融胶 ，每3-5孔为一组。1000rpm离心5min弃去液体，保留沉淀。

 

（3）添加适量类器官冻存液，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例，密度为2-3个孔冻存1管，每管体积1ml。

 

（4）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

 

4、类器官复苏

 

（1）取10ml DMEM/F12基础培养基于15ml离心管中。

 

（2）从液氮罐中取出冻存的类器官，快速置于 37℃水浴锅中融解。

 

（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min内完全融解。

 

（4）将溶解后的类器官快速转移至15ml 离心管，使用移液器轻轻吹打6-8次1000rpm 离心 5min，然后除去上清液并收集类器官沉淀。

 

（5）基质胶重悬，每孔25-30ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中20-30min成胶，添加适量小鼠结肠类器官完全培养基。

 

 

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