小鼠骨髓来源树突状细胞诱导分化完全指南：从细胞因子选择到功能验证

树突状细胞作为免疫系统的“哨兵”与“司令”，是连接天然免疫与适应性免疫的核心桥梁。其中，骨髓来源的树突状细胞因其易于大量获得、可定向诱导分化，已成为体外研究DC生物学、抗原呈递、T细胞激活及免疫调控的黄金标准模型。

 

面对不同的科研目标——是需要激发强大的T细胞反应，还是研究免疫耐受机制？选择正确的细胞因子组合是成功的关键。本篇指南将化繁为简，深度剖析如何利用细胞因子套装，在体外高效诱导出功能特异的小鼠BMDC。

 

第一部分：理论基石——理解BMDC的两大分化路径

 

小鼠骨髓前体细胞在体外主要可被诱导分化为两大类功能迥异的DC：

 

常规DC： 由GM-CSF驱动分化。这类细胞高表达MHC II类分子和共刺激分子（CD80, CD86），具有强大的抗原呈递能力，能有效激活初始T细胞，是研究炎症、感染和抗癌免疫中最常用的模型。

 

浆细胞样DC： 由Flt3-Ligand驱动分化。这类细胞以大量产生I型干扰素为特征，在抗病毒免疫和某些自身免疫病中发挥核心作用。

 

第二部分：核心武器库——驱动BMDC分化的核心信号通路

 

细胞因子本身是“信使”，而信号通路是细胞内的“指令执行系统”。以下是诱导BMDC中最关键的几条通路：

 

JAK-STAT信号通路

 

这是绝大多数细胞因子发挥作用的核心通路。

 

作用模式：细胞因子（如GM-CSF, IL-4, Flt3-L）与细胞膜表面的受体结合，导致受体构象改变，激活与其相关联的JAK激酶。活化后的JAK磷酸化受体，为STAT蛋白提供停泊位点。STAT蛋白被磷酸化后，形成二聚体，转入细胞核内，作为转录因子直接调控特定基因的表达。

 

举例：GM-CSF主要通过JAK2/STAT5通路驱动髓系前体细胞向cDC分化。

 

NF-κB信号通路

 

这是DC成熟过程的“主控开关”。

 

作用模式：成熟刺激信号（如LPS通过TLR4，TNF-α通过其受体）可激活IKK复合物，进而磷酸化降解IκB蛋白，使NF-κB二聚体（如p65/p50）得以释放并进入细胞核，启动大量促炎细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-12）、趋化因子和共刺激分子（CD80, CD86）的基因转录。

 

MAPK信号通路

 

协同调节细胞增殖、存活和炎症反应。

 

作用模式：同样由多种刺激（包括生长因子、应激、LPS）激活，包括ERK、JNK、p38等分支。在DC中，p38 MAPK通路对IL-12的产生至关重要。

 

第三部分：功能极化——从“哨兵”到“司令”的升级

 

收获的未成熟BMDC具有很强的抗原吞噬能力，但呈递功能不强。要使其成熟为能高效激活T细胞的“完全体”，需要施加成熟刺激。

常见的成熟刺激剂/细胞因子套装：

 

LPS（脂多糖）： 模拟细菌感染。常用100-500 ng/ml刺激12-24小时。能强力诱导共刺激分子和促炎细胞因子的表达。

 

Poly(I:C)（聚肌胞:聚胞苷酸）： 模拟病毒感染。常用10-50 µg/ml刺激12-24小时。

 

细胞因子组合： 如TNF-α + IL-1β + PGE2的组合，可以模拟炎症环境，诱导产生高表达CCR7、具备强大淋巴结归巢能力的成熟DC。

 

 

第四部分：实战方案——小鼠BMDC诱导分化方案

 

1. 小鼠骨髓细胞获取
   
   1.1 将6-8周龄小鼠颈椎脱臼法处死，取股骨，去除骨周围的肌肉组织。
   
   1.2 用75%酒精浸泡消毒股骨2分钟，PBS清洗2次。
   
   1.3 用剪刀剪去股骨两端，用注射器抽取PBS，针头从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗直至骨变白。
   
   1.4 收集骨髓悬液，用200目尼龙网过滤。
   
   1.5 滤液1200rpm离心5分钟，弃上清。
   
   1.6 加入2ml 红细胞裂解液，室温裂解3-5分钟。
   
   1.7 加入10ml PBS，1200rpm离心5分钟。
   
   1.8 弃上清，加入PBS清洗1次，用10%FBS的1640培养基重悬细胞。
   
   
2. BMDC诱导
   
   2.1 用培养基将细胞密度调整为1e6/mL，同时加入GM-CSF (UA040056) (20ng/mL)和IL-4 (UA040192) (20ng/mL)，此为D0。
   
   2.2 每2天进行半换液，即取出半量培养基，离心收集悬浮细胞，用等体积的培养基重悬，并补充相应浓度的细胞因子后加入皿中。
   
   2.3 D6收集悬浮细胞和贴壁细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清将细胞密度调整为1e6/mL，同时加入GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，此为不完全成熟的BMDC。
   
   2.4 BMDC的完全成熟：在D8加入TNF-α (20ng/mL)，GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，D10收集悬浮细胞和贴壁生长的细胞。

3.不完全成熟BMDC检测

3.1 收集细胞：细胞因子干预后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹打重悬。

3.2 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，并将按照1e7/mL重悬。

3.3 细胞封闭：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。

3.4 孵育抗体：各加入以下抗体，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。

组1：PE anti-mouse CD11c Antibody (117307) (抗体用量参考说明书）

APC anti-mouse CD80 Antibody (104713) (抗体用量参考说明书）

组2：PE anti-mouse CD11c Antibody (117307) (抗体用量参考说明书）

APC anti-mouse CD86 Antibody (105011) (抗体用量参考说明书）

3.5 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，去除残留的抗体，并再次用PBS重悬。

3.6 死活染料染色：每孔加入7-AAD (559925)，室温避光孵育5min。

3.7 上机检测。

4. 完全成熟BMDC检测
   
   4.1 收集细胞：细胞因子干预后，弃培养基上清，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将贴壁细胞用PBS轻轻吹打重悬。
   
   4.2 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，并将按照1e7/mL重悬。
   
   4.3 细胞封闭：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。
   
   4.4 孵育抗体：各加入以下抗体，4℃孵育30min，300Xg 离心5min，弃上清。
   
   组1：PE anti-mouse CD11c Antibody (117307) (抗体用量参考说明书）
   
   APC anti-mouse CD80 Antibody (104713) (抗体用量参考说明书）
   
   组2：PE anti-mouse CD11c Antibody (117307) (抗体用量参考说明书）
   
   APC anti-mouse CD86 Antibody (105011) (抗体用量参考说明书）
   
   4.5 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，去除残留的抗体，并再次用PBS重悬。
   
   4.6 死活染料染色：每孔加入7-AAD (559925)，室温避光孵育5min。
   
   4.7 上机检测。
   
   
   

https://www.ua-bio.com/ua090008_bmdc_differentiation_cytokine_set_mouse_%E5%B0%8F%E9%BC%A0bmdc%E8%AF%B1%E5%AF%BC%E5%88%86%E5%8C%96%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%9B%A0%E5%AD%90%E5%A5%97%E8%A3%85.html