细胞凋亡检测技术：Annexin V与Caspase 3/7方法学比较及应用指南

引言

细胞凋亡（Apoptosis）是基因调控的程序性细胞死亡过程，在胚胎发育、组织稳态维持、免疫清除及疾病发生中发挥关键作用。精确检测细胞凋亡对于癌症研究、药物开发、毒理学评估和免疫学研究至关重要。本文系统介绍三种主流凋亡检测试剂盒：Annexin V-FITC/7-AAD、Annexin V-FITC/PI 和 Caspase 3/7 Assay，从原理、操作流程到应用场景进行全面比较，为研究者提供方法学选择依据。

 

一、Annexin V细胞凋亡检测技术

1.1 检测原理

Annexin V是一种35-36 kDa的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力。在正常活细胞中，PS位于细胞膜内侧；凋亡早期，PS外翻至细胞膜外层，Annexin V-FITC通过结合PS发出绿色荧光，标记早期凋亡细胞。

7-AAD/PI不能穿透完整细胞膜。当细胞进入晚期凋亡或坏死阶段，细胞膜完整性丧失，7-AAD/PI进入细胞与DNA结合，产生荧光。通过双参数流式分析，可区分：

- 活细胞：Annexin V⁻/7-AAD or PI⁻

- 早期凋亡细胞：Annexin V⁺/7-AAD or PI⁻

- 晚期凋亡/坏死细胞：Annexin V⁺/7-AAD or PI⁺

 

1.2 标准操作流程

以Annexin V-FITC /PI 细胞凋亡检测试剂盒为例，操作流程如下：

1.用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，然后用1× Binding Buffer重悬所需数量的细胞，调整浓度为1 x 10^6细胞/毫升。

2.取 100 µL 细胞悬液（含1 x 10^5 cells个细胞）转移至 5 mL 流式检测管中。

3.向细胞悬液中加入 5 µL FITC Annexin V 和 1 µL碘化丙啶(PI)。对于荧光强度较高的样本，可将染料稀释 2 至 10 倍后使用。

4.轻轻涡旋混匀细胞，于室温（25°C）避光孵育 15 分钟。

5.使用200 µL 1× Binding Buffer洗涤细胞两次。

6.用 200 至 400 µL 的 Annexin V Binding Buffer重悬细胞。

7.在 1 小时内进行流式细胞仪分析。

 

1.3 结果展示

Annexin V FITC 染色的流式细胞术分析。Jurkat 细胞（人T淋巴细胞白血病细胞）在 5 µL（1 µg）Annexin V FITC和碘化丙啶(PI)的缓冲液中孵育。

结果图：(A)未染色。(B) PI单染。(C) Annexin V FITC单染。(D) Annexin V FITC 和 PI。

 

应用场景与局限性

应用场景：

- 药物毒性评估：量化化疗药物诱导的凋亡比例

- 免疫学研究：分析T细胞活化诱导的细胞死亡

- 炎症疾病模型：研究Crohn病等疾病中的异常凋亡

 

技术局限：

- 无法区分凋亡与其他PS暴露的细胞死亡形式（如坏死性凋亡）

- 钙离子浓度敏感：需严格使用Annexin V结合缓冲液维持Ca²⁺浓度

- 结合可逆性：长时间分析可能导致信号衰减

- 贴壁细胞检测困难：推荐胰酶温和消化或使用Caspase检测替代

 

相关产品：

货号	品名
UA070133	Annexin V-FITC /PI 细胞凋亡检测试剂盒
UA070132	Annexin V-FITC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒

 

二、Caspase 3/7 Assay：凋亡执行者的活性检测

2.1 检测原理

即用型 Caspases 3/7 细胞凋亡检测试剂盒用于定量检测细胞中 Caspases 3 和 7的活性。将该试剂加入待测细胞后，细胞裂解释出的 Caspases 3/7 切割试剂中的 Caspases 3/7 特异性的多肽荧光素偶联底物从而释出荧光素，试剂中的荧光素酶可以催化荧光素反应而产生光，光的强度和 Caspases 3/7 的活性成正比关系。

该试剂具有信噪比高、重复性好、稳定性好的特点。均质即用型的配方减少了实验准备和操作步骤，降低了因为多次加样导致的误差，且其稳定的辉光信号使该产品尤其适合高通量的化合物筛选。

 

2.2 实验流程与数据

1. 细胞准备

1) 在 96 孔或 384 孔白色细胞培养板铺合适密度的细胞。

2) 根据实验设定，细胞孵育一定时间后将合适浓度的待检测化合物加到细胞板孔中。建议设置只加溶剂载体的细胞对照（阴性对照）和只加溶剂载体的细胞培养基对照（空白对照）。

3) 根据实验需求继续培养合适的时间诱导细胞凋亡。

 

2. Caspases 3/7 细胞凋亡检测

1) 取出Caspases 3/7 细胞凋亡检测试剂，在室温平衡 20 分钟。轻摇混匀。

2) 取出待测细胞培养板，在室温平衡 20 分钟。

3) 加 50 µl 的检测试剂到 100 µl 96 孔板细胞中, 或 10 µl 试剂到 20 µl 384 孔板细胞中，振板 2 分钟，放置暗处室温孵育 30-60min 。荧光信号一般在加入检测试剂 1hr 左右达到最大值。最早可以在加入检测试剂后 30min 读板, 最晚不要超过 3hr。

4) 在luminescence 读板仪上读取荧光信号 。

 

Caspases3/7细胞凋亡检测试剂检测化合物Staurosporine(STSP)对HeLa细胞凋亡的作用：4x105/ml 的HeLa细胞接种于96孔白板透明底培养板，100µl/孔。24小时后加入3倍稀释的STSP，37℃5%CO2孵育6hr后按照Caspases3/7细胞凋亡检测试剂的说明进行Caspases3/7活性检测。图1示加入检测试剂后30min-130min读取荧光值的剂量曲线。

 

Caspases3/7细胞凋亡检测灵敏度测试：1μMSTSP处理HeLa细胞6hr后，两倍系列稀释的STSP处理的HeLa细胞接种于96孔透明底白板，100µl/孔；细胞浓度为25，000-180cell/well。按照Caspases3/7 细胞凋亡检测试剂的说明进行Caspases3/7活性检测。左图示在检测的40min-70min，荧光信号和细胞凋亡数成线性相关（R2>0.99），可以检测低至200个凋亡细胞。右图示1μMSTSP和溶剂DMSO处理HeLa细胞6hr后进行Caspases3/7活性检测(70min荧光检测数值)。

 

核心优势：

- 功能特异性：直接检测凋亡执行分子，特异性高于Annexin V

- 动态监测：可在活细胞中实时追踪凋亡进程

- 信号稳定：不可逆性底物允许固定后分析

 

相关产品：

货号	品名
UA079012	UA-Glo® Caspase 3/7 Assay

 

三、方法学比较

3.1 参数全面对比

特性	Annexin V-FITC/7-AAD Annexin V-FITC/PI	Caspase 3/7 Assay
检测原理	Annexin V 结合磷脂酰丝氨酸（PS），检测早期凋亡；7-AAD /PI 标记晚期凋亡/坏死细胞膜破损的细胞	利用 Caspase-3/7 切割底物（含DEVD序列），释放荧光素，产生化学发光信号，检测 Caspase 活化
检测目标	细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻（早期凋亡）和细胞膜完整性（晚期凋亡/坏死）	Caspase-3/7 酶活性（凋亡执行阶段的关键指标）
检测方式	流式细胞术（首选），也可用于荧光显微镜	化学发光/荧光读数（酶标仪），高通量筛选适用
区分阶段	可区分： • 活细胞（Annexin V-/7-AAD /PI-） • 早期凋亡（Annexin V+/7-AAD /PI-） • 晚期凋亡/坏死（Annexin V+/7-AAD /PI+）	不直接区分凋亡阶段，反映 Caspase 活化程度，通常用于凋亡程度的定量
定量能力	半定量，通过流式细胞术计算各群细胞百分比	定量，通过标准曲线可计算相对或绝对活性
灵敏度	高，可检测早期凋亡	高，对 Caspase 活化非常敏感
速度与通量	单样本检测，通量较低，需逐个样本上机	适合高通量，96 或 384 孔板，可批量检测
是否需要活细胞	是，检测过程需保持细胞相对完整	否，可使用裂解液裂解细胞后检测
适用场景	常规凋亡检测,免疫学研究	高通量药物筛选、凋亡通路研究

 

3.2 联合应用策略

Annexin V + Caspase 3/7双染：

- 时序分析：Annexin V标记早期凋亡，Caspase 3/7标记执行阶段，可构建凋亡时间曲线

- 验证增强：Annexin V阳性但Caspase 3/7阴性可能为非凋亡性PS暴露

- 单细胞解析：流式分析两个参数的相关性，揭示细胞异质性

 

四、总结

Annexin V-FITC/7-AAD、Annexin V-FITC/PI和Caspase 3/7 Assay构成了互补的凋亡检测工具箱。Annexin V系列适合快速、高通量的早期凋亡筛选，其中7-AAD在多色实验中光谱优势更明显；Caspase 3/7 Assay则提供执行阶段的分子确认，特异性更高且允许固定分析。

随着单细胞测序和多组学技术发展，这些经典方法正与新兴技术融合，例如在流式分选后结合单细胞RNA测序，揭示凋亡细胞的转录组特征。掌握这三种技术的原理与优化策略，将为细胞死亡研究提供坚实的技术基础。