天然多酚鞣酸通过协同激活GPX4抑制阿尔茨海默病铁死亡的作用机制

一、研究背景：铁死亡与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性认知障碍为特征的复杂神经退行性疾病，其发病机制涉及淀粉样蛋白-β（Aβ）沉积、Tau蛋白异常磷酸化、氧化应激及神经炎症等多种病理过程。近年来，一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式------铁死亡，被证实与AD的发生发展密切相关。铁死亡的标志包括细胞内铁离子蓄积、脂质过氧化水平升高以及核心抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的活性受损或表达下调。因此，开发能够同时靶向AD核心病理（如Aβ聚集）和铁死亡通路（尤其是增强GPX4功能）的多功能分子，是极具前景的治疗策略。

二、研究工具：GPX4 Flag&His tag 蛋白在机制验证中的核心作用

为精确验证化合物对GPX4活性的直接调控作用，高纯度、功能完整的重组蛋白是研究的基础。GPX4 Flag&His tag 蛋白 作为关键的体外研究工具，其双重标签便于通过亲和层析高效纯化，并可通过Flag标签进行特异性免疫检测，确保了酶学实验的准确性与高信噪比。在本研究中，该工具蛋白被用于：

1. 酶活性的直接测定：在体外生化体系中，直接评估多酚化合物（如鞣酸，TA）对GPX4催化活性的影响，定量分析其激活或抑制效应。

2. 抑制剂/激活剂的机制研究：通过该重组蛋白，能够模拟GPX4特异性抑制剂RSL3的抑制作用，并验证TA等化合物逆转此抑制或直接增强酶活性的能力，从而明确其作用位点（变构激活位点）。

3. 分子对接与结构验证：以纯化的GPX4蛋白结构模型为基础，进行小分子（TA，EGCG，RSL3）的分子对接模拟，预测其结合位点（如底物结合位点或变构调节位点），为功能实验结果提供结构层面的解释。

三、核心发现：鞣酸（TA）的多功能神经保护作用

本研究系统筛选并评估了一系列天然多酚在AD和铁死亡相关模型中的保护活性，发现鞣酸表现出最全面的协同效应。

1. 强大的铁螯合与抗氧化能力：TA凭借其结构中的多个邻苯二酚/没食子酸酯基团，展现出最强的铁离子结合能力（结合常数KB = 6.64 × 10^5 M^-1），能有效稳定铁离子，抑制其参与氧化还原循环，从而从源头上减少自由基和活性氧（ROS）的生成，并在体外模型中有效抑制铁依赖的脂质过氧化和蛋白质氧化。

2. 抑制Aβ与Tau蛋白异常聚集：TA能显著延迟Aβ42的聚集过程（延长聚集滞后时间，降低一级聚集速率），并能有效抑制Tau蛋白的聚集。值得注意的是，即使在Fe³⁺存在促进Aβ聚集的条件下，TA仍能保持显著的抑制活性，这与其铁螯合功能协同作用，共同对抗AD的蛋白质病理。

3. 直接靶向并激活GPX4酶活性：这是本研究的关键创新发现。分子对接预测表明，TA可与GPX4的变构激活位点结合。体外酶活性实验利用GPX4 Flag&His tag 蛋白 直接证实：

- 逆转抑制：TA能有效逆转GPX4特异性抑制剂RSL3对酶活性的抑制，使RSL3的半数抑制浓度从17.17 μM提高至29.98 μM。

- 直接激活：TA自身能以浓度依赖性的方式直接增强GPX4的酶活性，在100 μM浓度下活性增强19%。这证明TA是一种天然的GPX4激活剂。

4. 协同作用机制整合：TA通过多管齐下的方式发挥保护作用：① 螯合铁离子，减少铁死亡触发因素；② 清除自由基，减轻氧化损伤；③ 抑制Aβ和Tau病理聚集；④ 直接增强GPX4这一细胞内关键的抗氧化防御酶活性。这种"开源节流"（减少损伤输入、增强防御输出）的协同机制，使其成为对抗AD中复杂的神经退行性病变和铁死亡的理想候选分子。

四、总结与展望

本研究首次系统揭示了天然多酚鞣酸（TA）作为一种多功能的分子药物候选者，能够同时靶向阿尔茨海默病的蛋白质聚集病理与铁死亡通路，尤其突出了其作为GPX4激活剂这一新颖且关键的作用机制。在整个研究过程中，GPX4 Flag&His tag 蛋白 作为核心的研究工具，为在分子水平上精确解析TA与GPX4的直接相互作用、验证其激活效应提供了不可或缺的实验平台。这一发现不仅为AD的治疗提供了新的候选分子和作用靶点（GPX4激活），也为开发兼具抗氧化、铁调节、抗蛋白质聚集及酶激活功能的合成多靶点药物提供了重要的设计思路和先导化合物。

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