基于SCF His Tag蛋白在水凝胶中实现可控固定及其对造血干细胞的功能调控研究

一、研究背景：生物材料对干细胞微环境的仿生设计

造血干细胞是维持终身造血功能的关键细胞群，其自我更新与分化的命运抉择受到骨髓微环境（niche）中多种细胞因子及细胞外基质的精密调控。为了在体外模拟这一复杂微环境以支持HSC的扩增与表型维持，将关键细胞因子（如干细胞因子）以可控、长效的方式整合至三维生物材料支架中，是组织工程与再生医学领域的重要策略。其中，甲基丙烯酰化明胶水凝胶以其优良的生物相容性、可调机械性能及易于光固化的特性，成为构建体外造血微环境的理想材料。然而，如何将细胞因子高效、稳定地固定于GelMA网络中，并保持其生物活性以精准调控HSC行为，是亟待解决的技术挑战。

二、SCF His Tag 蛋白作为研究工具的优势

在进行细胞因子固定化策略的研究中，高纯度、易于追踪和操作的重组蛋白是基础。SCF His Tag 蛋白 在此类研究中具有独特价值：

1. 高纯度保障： His标签便于通过金属螯合层析进行高效纯化，获得高纯度的SCF蛋白，确保固定化研究的起点明确，减少杂质干扰。

2. 功能验证基础： 可直接用于验证修饰或固定化处理是否影响其与c-Kit受体的结合能力及下游信号激活功能，为后续生物材料的构建提供活性保障。

3. 固定化策略通用性： 其N末端或C末端的His标签为后续可能的定点偶联策略（如通过金属配位或His标签特异性化学反应）提供了额外的化学手柄，增加了固定化方式的灵活性。

三、SCF的化学固定化策略：基于丙烯酰化PEG-NHS的交联方法

为实现SCF在GelMA水凝胶中的长效、可控负载，研究采用了一种两步化学偶联策略：

1. 蛋白功能化： 利用丙烯酰化聚乙二醇活性酯（AC-PEG-NHS）与SCF His Tag 蛋白 表面的伯氨基（赖氨酸残基）在温和条件下（pH 8.0 PBS缓冲液）反应。这一步骤在SCF分子上共价连接了末端带有丙烯酸酯双键的PEG链，得到"双键化"的PEG-SCF偶联物。通过凝胶电泳（如SDS-PAGE）的分子量迁移变化可以验证修饰成功。

2. 水凝胶共价固定： 将修饰后的PEG-SCF偶联物与GelMA预聚液混合，在光引发剂存在下进行紫外光照射。在此过程中，GelMA上的甲基丙烯酸酯双键与PEG-SCF上的丙烯酸酯双键通过自由基共聚反应形成共价网络，从而将SCF永久性地锚定在三维凝胶骨架中。

四、不同负载模式对SCF释放动力学及生物活性的影响

为评估化学固定策略的优势，研究系统比较了四种不同的SCF负载模型对HSC功能的影响：

1. 无SCF负载组： 作为阴性对照。

2. 物理混合组： 将SCF His Tag 蛋白 简单混合于GelMA前驱液中，通过物理包埋负载。

3. 持续补充组： 在物理混合的基础上，于培养培养基中持续添加可溶性SCF。

4. 共价固定组： 采用上述AC-PEG-NHS策略将SCF共价固定于GelMA网络中。

研究结果显示：

- 释放动力学： 物理混合的SCF在12小时内快速释放（约60%），而共价固定的SCF在7天内仍能保留超过80%，实现了长效、稳定的局部信号呈递。

- 生物活性保留： 通过细胞增殖实验验证，经AC-PEG-NHS修饰和共价固定后的SCF，其促进HSC增殖的生物活性得到了有效保留。

五、共价固定SCF对造血干细胞功能的选择性调控

在GelMA三维培养体系中，共价固定SCF展现出独特的生物学效应：

1. 增殖与表型调控： 与可溶性SCF持续刺激导致HSC快速扩增不同，在含有共价固定SCF的水凝胶中培养的HSC，其总增殖速度相对较缓。

2. 维持原始性： 更重要的是，共价固定SCF的环境显著提高了维持原始表型（如Lin⁻Sca-1⁺c-Kit⁺表型）的HSC亚群的比例。这表明，由水凝胶基质局部、持续呈递的SCF信号，更有利于模拟体内微环境的生态位功能，促进HSC的自我更新而非快速分化，实现了对HSC命运的选择性调控。

六、总结与展望

本研究通过AC-PEG-NHS交联策略，成功将SCF His Tag 蛋白 长效、活性地共价固定于GelMA水凝胶中，构建了一种能够模拟骨髓生态位关键信号特征的仿生三维微环境。该策略不仅解决了细胞因子在材料中快速流失的问题，更重要的是，揭示了信号呈递方式（可溶性扩散 vs. 基质固定）对HSC命运的深刻影响。这为设计下一代用于造血干细胞体外扩增、维持或分化的智能生物材料提供了重要的设计原则和方法学借鉴。未来，结合其他细胞因子或黏附配体的协同固定，有望构建出功能更加完备、调控更为精细的复合型人工造血微环境。