Extraction-free One-Step RT-qPCR为染料法（SYBR Green I）, 为保证检测特异性及灵敏度，RT-qPCR各参数需要进行优化，特别是引物设计和细胞数量至关重要。qPCR最佳引物位于相邻外显子交界，此类引物只能以mRNA为模板进行扩增；或引物分别位于相邻外显子，而且外显子之间的内含子比较长，引物以基因组DNA为模板的扩增效率远低于以mRNA为模板的扩增，因此基因组DNA为模板的扩增可以忽略。引物设计还要考虑尽量消除引物二聚体。建议用专业的引物设计程序，例如Primer 3, IDT PrimerQuest, Primer-BLAST进行引物设计，选取2-3对引物进行测试，选择最优引物对进行实验。
检测细胞需要在50至20,000个细胞范围内（50 ml细胞裂解L试剂, 1-400细胞/ml），根据基因表达丰度优化细胞裂解液加入RT-qPCR反应的数量，建议20 ml的RT-qPCR反应体系不超过400个细胞, 细胞裂解液体积不超过2ml。
有关DNase I处理: 许多情况下，例如假基因，不含内含子的基因，或未知因素等都会使通过引物设计来避免基因组DNA扩增成为不可能。DNase I 处理可以降解基因组DNA, 降低基因组DNA扩增的影响。mRNA的表达丰度也会决定基因组DNA扩增对mRNA定量的影响。高表达的mRNA数量对基因组DNA基因拷贝数是大大过量的，因此有RT和无RT的产物差距>10 Ct, 而且由于模板竞争的关系，在RT-qPCR反应中基因组DNA扩增几率远小于高丰度mRNA，因此基因组DNA扩增对基因定量的影响可以忽略。极低表达的基因mRNA（每个细胞几个mRNA）数量对基因组DNA基因拷贝数是相当的，此类情况要依靠DNase I 降解基因组DNA, 降低基因组DNA扩增的影响, 此时可以延长细胞裂解/DNase I处理时间至20min以更好地降解基因组DNA。测定已知不存在DNA阶段的生物的基因，例如流感病毒感染细胞后测定细胞内流感病毒基因的表达可以不在L试剂中加入DNase I。
1. 细胞准备：检测细胞需要在50至20,000个细胞范围内。贴壁细胞（96-孔或384-孔）吸去培养液后，用预冷的PBS洗涤一次， 尽量弃去PBS后，按步骤3加入细胞裂解液。悬浮细胞离心吸去培养液后，用预冷的PBS洗涤一次，尽量弃去PBS后，用5 ml预冷的PBS重悬细胞后转入96-孔板，按步骤3加入细胞裂解液
2. 细胞裂解液加DNase I配制：DNase I为100x, 990 ml细胞裂解L试剂加入10 ml DNase I
3. 向步骤1准备的细胞培养板（96-孔或384-孔）每孔加50 ml 细胞裂解L试剂(DNAse I)，小心吹打5次，室温孵育10分钟。（如有需要，为了更好降解基因组DNA，可以延长孵育时间至20分钟）
4. 细胞培养板每孔加5 ml 细胞裂解终止S试剂，小心吹打5次，室温孵育2分钟。（此细胞裂解产物可以作为RT-qPCR 的模板，建议立即进行RT-qPCR反应，冰上保存时间不超过4小时。短期-20℃保存1周，长期可保存于-80℃）
5. RT-qPCR 反应组装：
建议在超净工作台内组装RT-qPCR反应，并且在不同的隔离区加入模板，包括细胞裂解样品和实验内参，避免交叉污染和气溶胶污染。所有实验使用无核酸酶的超纯水，枪头和反应管。建议使用带滤芯的枪头，特别是在加入模板时，防止加样枪头产生交叉污染。
建议RT-qPCR 为20μl反应体系，冰上组装。试剂盒RT-qPCR Mix试剂为5x, 按下表加入基因特异性引物（终浓度100-400 nM），细胞裂解产物（0.5-2 μl，步骤1-4制备）和ROX。其中ROX用量需基于不同的qPCR仪器：不需要ROX的qPCR仪器， 需高浓度ROX的qPCR仪器按100x加入（0.2 μl /20 μl反应）或需低浓度ROX的qPCR仪器按1000x加入（0.02 μl /20 μl反应）。主要qPCR仪器和ROX浓度需要见附录，或咨询qPCR仪器使用手册和生产商。
20μl RT-qPCR反应体系
RT-qPCR Mix （5x） | 4 μl |
基因特异性引物对 | 建议每个引物终浓度为200 nM |
细胞裂解产物（模板） | 建议0.5-1μl，不超过2μl，细胞数不超过400个 |
ROX | 0μl(无ROX), 0.2μl(高 ROX) 或0.02μl(低 ROX） |
超纯水（无核酸酶） | 加至20μl |
6. RT-qPCR扩增条件：
RT-qPCR扩增分为逆转录，Taq酶激活和PCR扩增三阶段。建议进行PCR扩增后的熔解曲线分析，特别是在优化实验条件阶段，以区分特异性与非特异性扩增及引物二聚体等。逆转录后激活Taq酶需严格按照95℃ 5分钟进行。以下示例PCR扩增条件为两步法，具体条件需要根据模板和引物进行优化，特别是退火/延长的条件，或按3步法进行扩增。
逆转录： 50℃, 5分钟
Taq酶激活：95℃ 5分钟 （必须条件，不要改动）
PCR扩增： 40个循环（95℃ 10 sec，60℃ 20sec/收集信号）
熔解曲线
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