Extraction-free One-Step RT-qPCR Kit（Probe）

该试剂盒由细胞裂解液 L 试剂，扩增缓冲液 B 试剂，扩增酶 mix E 试剂组成。具体规格如下：

1.细胞准备：待检测孔细胞需要在25至15000个细胞范围内。贴壁细胞吸去培养液后，用室温的DMEM无血清培养液洗涤一次，弃洗涤液后，加细胞裂解液。悬浮细胞离心吸去培养液后，用室温的DMEM无血清培养液洗涤一次，弃洗涤液后，加细胞裂解液。

2.细胞裂解：96孔培养板每孔加50μl L试剂，384孔培养板每孔加10μl L试剂，轻拍培养板数次，室温振摇10至15分钟。细胞裂解产物（lysate）使用完之后需要尽快放回2～8℃保存，低温保存时间不超过8小时。不建议长期保存细胞裂解产物。

3.RT-qPCR准备：按下列次序准备20μl 反应体系：10μl B试剂，4μl E试剂，2μl 引物探针mix，2μl 细胞裂解产物模板，2μl 无酶水。20μl 反应体系中细胞裂解产物不建议超过2μl 。

4.RT-qPCR扩增：逆转录42～50℃,20～30分钟，然后95℃1分钟。qPCR参数需要根据特定的目标基因及引物序列的预实验结果确定。以下是一个housekeeping基因的扩增设定，供参考：
逆转录：45℃，20分钟；然后95℃1分钟。
PCR扩增：94℃20秒，56℃20秒，65℃20秒（收集荧光信号），35～40个循环；然后72℃3分钟。

5.必要时进行熔解曲线分析。

6.结果分析。

1. 引物设计：需要以 RNA 序列为依据，扩增产物至少覆盖 2 个外显子，确保扩增系统不能以基因组 DNA 为模板进行扩增，而只能以 RNA 为模板进行扩增。在下列情况下可以实现：a. 2 个外显子之间的内含子比较长，以基因组为模板的扩增长度明显超出系统中的聚合酶在扩增延伸时间内所能完成的扩增长度；b. 2 个外显子之间的内含子比较短，但至少有一条引物的最 3 末端的 2～5 个碱基与其 5 末端一侧的其余碱基分布在不同的外显子上且与邻近内含子碱基序列不同（参考下图），使得以 DNA 为模板的扩增成为不可能。必要时请联系产品技术支持协助。

2. 探针设计：探针长度 18～28 个碱基，Tm 比引物高 8～10 ℃, 不含3个以上连续的 G，5’末端不是 G。探针 5’末端带荧光基团，3’末端带淬灭基团。

3. PCR 扩增参数及体系：任何一个 PCR，任何一套扩增引物探针，都需要经过预实验，确定最佳扩增温度与时间设定，引物量，酶量，甚至 Mg2+ 浓度调整，这对检测特异性与灵敏度非常重要。需要做类似细胞数梯度检测预实验，在获得良好的线性关系之后再开始微孔板大通量实验。

4. 熔解曲线：熔解曲线分析可以完美地区分特异性的与非特异性的扩增。熔解曲线分析在预实验实验参数确定过程中就需要使用。荧光探针扩增体系做熔解曲线前需要在扩增完成后加入双链 DNA 结合的荧光染料（如 SYBRGreen），标记在探针上的荧光染料不能用于熔解曲线分析。