UA-Blue SEAP Detection Kit

1. 细胞铺板与准备
将表达SEAP报告基因的细胞铺在96孔或384孔板中。
如果使用含FBS的培养基：将FBS在56°C下热灭活30分钟，以消除内源性碱性磷酸酶（AP）活性。

2. 细胞处理与刺激
根据需要，用测试化合物处理细胞并刺激报告基因表达。

3. 样本收集与预处理
在刺激后所需的时间点收集细胞培养上清液。对于内源性AP背景较高的样本：可选择将样本在65°C下加热5-10分钟以灭活干扰性磷酸酶。
注意：UA-Blue SEAP检测试剂可抑制低水平的内源性AP，而不影响SEAP活性。

4. 试剂准备
在使用前将检测试剂平衡至室温（RT）。
缓冲液处理（40×Buffer）
可能会略显浑浊（无沉淀）——稀释前充分涡旋。
保存：4°C：稳定2周；-20°C：长期保存。

底物处理（250×Substrate）
外观：红棕色溶液；在保存过程中可能会形成沉淀。
重新溶解：剧烈涡旋1-2分钟，或在37°C下孵育5-10分钟。
保存：4°C：稳定4周；-20°C：长期保存。

5. 1×工作液配制
示例（40 mL 1×检测试剂）：
将1 mL 40×Buffer稀释在39 mL无菌水中 → 1×Buffer。
加入167 µL 250×Substrate → 立即发生絮凝。立即涡旋至完全溶解（清澈溶液）。延迟混合会导致不可逆的沉淀。

6. HTS优化（例如，1536孔板）
准备3×或6×浓缩的检测试剂，以减少移液步骤。
示例：3×试剂（2 µL）+ 4 µL样本 → 最终浓度为1×。
1×/3×/6×检测试剂的保存：4°C，稳定1周（可能会有轻微沉淀；使用前涡旋）。

7. 实验设置（96孔板示例）
每孔加入20 µL样本/对照。
加入180 µL 1×检测试剂。
在振板机上混合（15秒）。

8. 孵育：37°C，30分钟至6小时（避光）。

9. 检测：使用酶标仪在600-650 nm（OD）处测量吸光度。

信号稳定性：应在添加试剂后6小时内进行读数。

HTS适应性：对于384/1536孔板，按比例减少体积。

干扰控制：对于高背景样本，建议进行65°C热预处理。