以384浅孔板为例
一、试剂准备
使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20uL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。
1、缓冲液（1×）配制
2mL Detection buffer （5×）中 加入8mL无菌水，混匀备用
表2. 试剂配置及用量
试剂名称 | 配置 | 用量（uL） |
AK-1690 | 按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。 保证所有检测孔中DMSO的含量一致。 | 2 |
Tag1-STAT6 protein | 取40uL Tag1-STAT6 protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。 | 4 |
Tag2- CRBN protein | 取40uL Tag2-CRBN protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。 | 4 |
Antibody Mix | 取50uL Anti-Tag1 Eu dye antibody 原液，加入 1×Detection buffer 2.45mL, 混匀； 取200uL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1× Detection buffer 2.3mL, 混匀，1:1混合为Antibody Mix。 | 10 |
2、待测样品梯度稀释
以AK-1690为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。
表3. 样品梯度稀释
| AK-1690终浓度（nM） | AK-1690配制浓度（nM） | 配置方法 |
① | 150 | 1500 | 2uL 150uM 母液+198uL 1× Detection buffer |
② | 100 | 1000 | 100uL ① +50uL 1× Detection buffer |
③ | 75 | 750 | 90uL ② +30uL 1× Detection buffer |
④ | 50 | 500 | 100uL ③ +50uL 1× Detection buffer |
⑤ | 25 | 250 | 50uL ④ +50uL 1× Detection buffer |
⑥ | 12.5 | 125 | 50uL ⑤ +50uL 1× Detection buffer |
⑦ | 6.25 | 62.5 | 50uL ⑥ +50uL 1× Detection buffer |
⑧ | 3.125 | 31.25 | 50uL ⑦+50uL 1× Detection buffer |
Blank | 0 | 0 | 100uL 1× Detection buffer |
二、加样及对照
1、实验孔加样顺序：4uL Tag1-STAT6 protein工作液，2uL待测样本，再加入4uL Tag2-CRBN protein工作液，10uL混匀的Antibody Mix（Tag2-CRBN protein可与Antibody Mix等比例混合后加入），依次加入384浅孔板中。
2、最低值对照孔：2uL 1× Detection buffer代替所检测样本；
3、最高值对照孔：2uL 1500nM AK-1690代替所检测样本；
4、NC(Eu only)：16uL 1× Detection buffer加4uL稀释后的Anti-Tag1 Eu dye antibody。
表4. 加样及对照
*阴性对照和NC，推荐使用与待测样品基质相同的溶液替代1×Detection buffer。
三、检测
在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。
四、结果计算
1、计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即信号值= (665/620)*10000
2、根据信号值计算Net Signal：Net Signal = (Std-NC)/NC*100
3、计算CV（%）
CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%
五、数据示例
以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。
AK-1690(nM) | Ratio | CV | Net Signal |
150 | 365.45 | 4% | 678.38 |
100 | 363.90 | 6% | 675.08 |
75 | 322.05 | 5% | 585.94 |
50 | 226.15 | 16% | 381.68 |
25 | 119.20 | 1% | 153.89 |
12.5 | 69.99 | 8% | 49.07 |
6.25 | 52.85 | 2% | 12.56 |
3.125 | 48.92 | 6% | 4.20 |
0 | 46.95 | 1% | |
Eu only | 26.87 | 3% | |
S/B | 7.75 | | |
EC50 | | | 46.44 |
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