1试剂准备
使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20μL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。
1.1 缓冲液（1×）
2mL Detection buffer （10×）中 加入18mL无菌水，混匀备用
表2. 试剂配置及用量
试剂名称 | 配置 | 用量（μL） |
PROTAC IRAK4 DEGRADER-1 | 按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。 | 2 |
Tag1-IRAK4 protein | 取40μL Tag1-IRAK4 protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。 | 4 |
Tag2-DDB1/CRBN protein | 取40μL Tag2-DDB1/CRBN protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。 | 4 |
Antibody Mix | 取50μL Anti-Tag1 Eu dye antibody 原液，加入 1×Detection buffer 至2.5mL, 混匀； 取200μL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1× Detection buffer 至2.5mL, 混匀，1:1混合为Antibody Mix。 | 10 |
1.2 待测样品梯度稀释
以PROTAC IRAK4 DEGRADER-1为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。
表3. 样品梯度稀释
| PROTAC IRAK4 DEGRADER-1终浓度（nM） | PROTAC IRAK4 DEGRADER-1配制浓度（nM） | 配置方法 |
| 150 | 1500 | 2μL 150μM 母液+198μL 1× Detection buffer |
| 75 | 750 | 50μL ① + 50μL 1× Detection buffer |
| 37.5 | 375 | 50μL ② + 50μL 1× Detection buffer |
| 18.75 | 187.5 | 50μL ③ + 50μL 1× Detection buffer |
| 9.38 | 93.75 | 50μL ④ + 50μL 1× Detection buffer |
| 4.69 | 46.88 | 50μL ⑤ + 50μL 1× Detection buffer |
| 2.34 | 23.44 | 50μL ⑥ + 50μL 1× Detection buffer |
| 1.17 | 11.72 | 50μL ⑦ + 50μL 1× Detection buffer |
| 0.59 | 5.86 | 50μL ⑧ + 50μL 1× Detection buffer |
Blank | 0 | 0 | 100μL 1× Detection buffer |
2 加样及对照
2.1 实验孔加样顺序：4μL Tag1-IRAK4 protein工作液，2μL待测样本，再加入4μL Tag2-DDB1/CRBN protein 工作液，10μL混匀的Antibody Mix，依次加入384浅孔板中。
2.2 最低值对照孔：2μL 1× Detection buffer代替所检测样本；
2.3 最高值对照孔：2μL 40000nM PROTAC IRAK4 DEGRADER-1代替所检测样本；
2.4 NC(Eu only)：16μL 1× Detection buffer加4μL稀释后的Anti-Tag1 Eu dye antibody。
表4. 加样及对照
| 最低值对照孔 | 最高值对照孔 | 样本 | NC |
第一步 | 2μL 1× Detection buffer | 2μL 1500nM PROTAC IRAK4 DEGRADER-1 | 2μL 梯度稀释待测样本 | 15μL 1× Detection buffer 加5μL 1×Anti-Tag1 Eu dye antibody |
4μL Tag1-IRAK4 protein |
第二步 | 4μL Tag2-DDB1/CRBN protein |
10μL Antibody Mix |
用封板膜封住板孔，室温孵育2小时； |
*阴性对照和NC，推荐使用与待测样品基质相同的溶液替代1×Detection buffer。
3.检测
在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。
【结果计算】
1. 计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即
信号值= (665/620)*10000
2. 根据信号值计算Net Signal：
Net Signal = (Std-NC)/NC*100
3.计算CV（%）
CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%
【数据示例】
以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。
PROTAC IRAK4 degrader-1 nM | Average | CV | Average |
125 | 231.3 | 5.0% | 621.35 |
62.5 | 225.4 | 5.7% | 602.95 |
31.25 | 169.4 | 2.7% | 428.30 |
15.625 | 102.335 | 5.2% | 219.15 |
7.8125 | 63.97 | 0.4% | 99.50 |
3.90625 | 50.34 | 11.3% | 56.99 |
0 (DMSO) | 38.455 | 4.1% | 19.93 |
Eu +AC | 32.155 | 2.9% | 0.28 |
S/B | 6.01 | | |
IC50 | | | 23.96 |
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