1试剂准备
使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20uL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。
1.1 缓冲液（1×）配制
2mL Detection buffer （10×）中 加入18mL无菌水，混匀备用
表2. 试剂配置及用量
试剂名称 | 配置 | 用量（μL） |
BET Degrader-1 | 按照反应体系，化合物用1×Detection buffer稀释到待测浓度。 保证所有检测孔中DMSO的含量一致。 | 2 |
Tag1-DDB1/CRBN protein | 取80μL Tag1-DDB1/CRBN protein原液，1× Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。 | 4 |
Tag2- BRD4 protein | 取20μL Tag2- BRD4 protein原液，1×Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。 | 4 |
Anti-Tag1 Eu dye antibody | 取50μL Anti-Tag1 Eu dye antibody 原液，加入 1×Detection buffer 2.45mL, 混匀备用。 | 5 |
Anti-Tag2 Ac antibody | 取200μL Anti-Tag2 Ac antibody 原液，加入 1× Detection buffer 2.3mL, 混匀备用。 | 5 |
1.2 Mix-1配制
Anti-Tag1 Eu dye antibody和Anti-Tag2 Ac antibody分别稀释后1:1混匀备用
1.3 样品2倍梯度稀释
以BET Degrader-1为例，稀释液为1× Detection buffer，为降低基质效应干扰，推荐使用与待测样品基质相同的溶液稀释；且待测样本根据实际浓度调整。
表3. 样品梯度稀释
| BET Degrader-1终浓度（nM） | 样品或标准品 | 溶液 |
阳性对照 | | 1 μL BET Degrader-1（100 μM） | 99 μL 1× Detection buffer |
① | 100.00 | 100μL 1μM BET Degrader-1 | 0 |
② | 50.00 | 50μL ① | 50μL 1× Detection buffer（1%DMSO） |
③ | 25.00 | 50μL ② | 50μL 1× Detection buffer（1%DMSO） |
④ | 12.50 | 50μL ③ | 50μL 1× Detection buffer（1%DMSO） |
⑤ | 6.25 | 50μL ④ | 50μL 1× Detection buffer（1%DMSO） |
⑥ | 3.13 | 50μL ⑤ | 50μL 1× Detection buffer（1%DMSO） |
⑦ | 1.56 | 50μL ⑥ | 50μL 1× Detection buffer（1%DMSO） |
⑧ | 0.78 | 50μL ⑦ | 50μL 1× Detection buffer（1%DMSO） |
⑨ | 0.39 | 50μL ⑧ | 50μL 1× Detection buffer（1%DMSO） |
⑩ | 0.20 | 50μL ⑨ | 50μL 1× Detection buffer（1%DMSO） |
Blank | 0 | | 100μL 1× Detection buffer（1%DMSO） |
2. 加样及对照
2.1 实验孔加样顺序：4uL Tag1-DDB1/CRBN protein，4μL Tag2- BRD4 protein，2μL BET Degrader-1或待检测样品，10μL混匀的Mix-1，依次加入384浅孔板中。
2.2 阴性对照孔（Blank）： BET Degrader-1或待检测化合物替换为2μL相同百分含量的DMSO溶液。
2.3 NC：16uL 1×缓冲液加4μL稀释后的Anti-Tag1 Eu dye antibody。
表4. 加样及对照
| 阴性对照 | 阳性对照 | 样本 | NC |
第一步 | 2μL 1× Detection buffer | 2μL 100nM BET Degrader-1 | 2μL 梯度稀释待测样本 | 15uL 1× Detection buffer 加5uL 1×Anti-Tag1 Eu dye antibody |
4μL Tag1-DDB1/CRBN protein |
4μL Tag2- BRD4 protein |
室温孵育10 min |
第二步 | 10μL Mix-1 |
用封板膜封住板孔，室温孵育2h； |
*阴性对照和质控，推荐使用与待测样品基质相同的溶液替代1×Detection buffer。
3.检测
在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。
【结果计算】
1. 计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即
信号值= (665/620)*10000
2. 根据信号值计算δ值：
δ值= (Std-NC)/NC*100
3.计算CV（%）
CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%
【数据示例】
以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。
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