1试剂准备
使用前将所有试剂室温融化（室温平衡至少30min）。384浅孔板反应体系为20uL（反应体系试剂用量如表所示），在配制之前计算实验所需体积，按需配制；以下配制仅供参考，以500次为例。
表2. 试剂配置及用量
试剂名称 | 配置 | 用量（μL） |
ARV-393 | 按照反应体系，化合物用Detection buffer稀释到待测浓度。 保证所有检测孔中DMSO的含量一致。 | 2 |
Tag1-DDB1/CRBN protein, | 取80μL Tag1-DDB1/CRBN protein原液， Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。 | 4 |
Tag2- BCL6 protein | 取20μL Tag2- BRD4 protein原液，Detection buffer稀释至2mL ,混匀备用。 | 4 |
Antibody Mix | 取50μL Anti-Tag1 Eu dye antibody，用Detection buffer稀释至2500μL，混匀；取50μL Anti-Tag2 LA，用Detection buffer稀释至2500μL，混匀，1:1混合为Antibody Mix。 | 10 |
1.1 待测样品梯度稀释
使用1×Detection buffer进行待测样品和标准品的配制。若样品的储液为DMSO，建议保持体系中DMSO 含量一致，(检测缓冲波中不含DMSO，请根据标准品或待测样品稀释情况向1×Detection buffer中添加DMSO)目最高不超过2%。试剂盒中ARV-393标准品为100μM DMSO 母液。请根据实验情况配制标准品总量，以下内容仅供参考。
表3. ARV-393梯度稀释
| ARV-393终浓度（nM） | ARV-393配制浓度（nM） | 配置方法 |
① | 400 | 4000 | 4μL 100μM 母液+96μL Detection buffer |
② | 200 | 2000 | 50μL ① +50μL Detection buffer (1%DMSO) |
③ | 100 | 1000 | 50μL ② +50μL Detection buffer (1%DMSO) |
④ | 50 | 500 | 50μL ③ +50μL Detection buffer (1%DMSO) |
⑤ | 25 | 250 | 50μL ④ +50μL Detection buffer (1%DMSO) |
⑥ | 12.5 | 125 | 50μL ⑤ +50μL Detection buffer (1%DMSO) |
⑦ | 6.25 | 62.5 | 50μL ⑥ +50μL Detection buffer (1%DMSO) |
⑧ | 3.125 | 31.25 | 50μL ⑦ +50μL Detection buffer (1%DMSO) |
⑨ | 1.5625 | 15.625 | 50μL ⑧ +50μL Detection buffer (1%DMSO) |
⑩ | 0.78125 | 7.8125 | 50μL ⑨ +50μL Detection buffer (1%DMSO) |
Blank | 0 | 0 | 100μL Detection buffer (1%DMSO) |
2 加样及对照
2.1 实验孔加样顺序：4uL Tag1-DDB1/CRBN protein，4uL L Tag2- BCL6 protein，2uL ARV-393 或待检测化合物，10uL混匀的Antibody Mix，依次加入384浅孔板中。
2.2 阴性对照孔（Blank）： ARV-393 或待检测化合物替换为2uL相同百分含量的DMSO溶液。
2.3 NC：15uL Detection buffer加5uL稀释后的Anti-Tag1 Eu dye antibody。
表4. 加样及对照
| 阴性对照 | 阳性对照 | 样本 | NC |
第一步 | 2μL Detection buffer稀释的DMSO（1%DMSO） | 2μL 4μM ARV-393 | 2μL 梯度稀释待测样本 | 15μL 1× Detection buffer（1%DMSO） 加5uL 1×Anti-Tag1 Eu dye antibody |
Tag1-DDB1/CRBN protein |
4uL L Tag2- BCL6 protein |
10μL Antibody Mix |
第二步 | 用封板膜封住板孔，室温孵育2h。 |
3.检测
在兼容TR-FRET的酶标仪上检测（激发光为320nm，检测620nm和665nm的发射波长）。
【结果计算】
1. 计算信号值：665nm荧光信号比620nm荧光信号再乘以10000，即
信号值= (665/620)*10000
2. 根据信号值计算δ值：
δ值= (Std-NC)/NC*100
3.计算CV（%）
CV（%）= Standard Deviation/Mean Ratio×100%
【数据示例】
以下数据不能代替实验中获得的数据，只作为示例，结果可能因TR-FRET兼容仪器而异。
ARV-393 ,nM | Ratio | CV(%) | Net Signal |
400 | 1568.00 | 30% | 317.47 |
200 | 3186.00 | 9% | 748.24 |
100 | 3240.50 | 2% | 762.75 |
50 | 1637.50 | 31% | 335.97 |
25 | 575.90 | 11% | 53.33 |
12.5 | 443.00 | 7% | 17.94 |
6.25 | 405.85 | 1% | 8.05 |
3.125 | 393.80 | 5% | 4.85 |
1.5625 | 390.50 | 2% | 3.97 |
0.78125 | 385.65 | 2% | 2.68 |
0 (DMSO) | 375.60 | 1% | 0 |
Eu only | 126.30 | 5% | |
S/B | 25.66 | | |
EC50 | | | 71 |
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