TR-FRET Human CRBN Ligand Screening Assay Kit
- 价格: ¥13,080
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产品组分
组分
浓度
体积(100T)
体积(500T)
体积(2500T)
体积(10000T)
保存条件
Thalidomide
10 mM in DMSO
5 μL
5 μL
25 μL
100 μL
-80℃
Tag1-CRBN/DDB1
100×
5μL
25μL
125μL
500 μL
-80℃
Thalidomide-Ac
100×
5μL
25μL
125μL
500 μL
-80℃
Anti-Tag1-Eu
50×
10μL
50μL
250 μL
1000 μL
-80℃
检测缓冲液
10×
250μL
1.2mL
6mL
21 mL
-80℃
*试剂应避免反复冻融,建议首次解冻后进行分装,按保存条件保存,有效期一年。
*使用前将试剂冰上融化,平衡至室温。
*所有试剂工作液现用现配。
操作步骤
试剂配置及用量
试剂配置及用量表
名称
试剂配置
每孔用量 (μL)
标准品或待测样品
使用稀释至1X的检测缓冲液进行待测样品和标准品的配制。若样品的储液为DMSO,建议保持体系中DMSO 含量一致,且最高不超过2%。标准品稀释见下表。
5
Tag1-CRBN/DDB1
母液为100X, 使用1X检测缓冲液100倍稀释后,混匀备用,例如,将2μL Tag1-CRBN/DDB11母液加入到198 μL 1X检测缓冲液中,即为200μL蛋白工作液。。
5
Thalidomide-Ac
母液浓度为100X,使用1X检测缓冲液100倍稀释后,每孔加样5μL, 例如,将2 μL Thalidomide-Ac母液加入到198 μL 1X检测缓冲液中,即为200μL工作液。
5
Anti-Tag1-Eu
母液浓度为50X,使用1X检测缓冲液50倍稀释后,每孔加样5μL, 例如,将2 μL Anti-Tag1-Eu母液加入到98 μL 1X检测缓冲液中,即为100μL工作液。
5
试剂盒中Thalidomide 标准品为10mM DMSO 母液。请根据实验情况配制标准品总量,以下内容仅供参考。
使用稀释至1X的检测缓冲液进行待测样品和标准品的配制。若样品的储液为DMSO,建议保持体系中DMSO 含量一致,(检测缓冲液中不含DMSO,请根据标准品或待测样品稀释情况向1X检测缓冲液中添加DMSO)且最高不超过2%。
标准品配置表
Standard
配制方法
配制浓度(nM)
终浓度(nM)
Std 10
1 μL标准品母液+ 82.3μL检测缓冲液
120000
30000
Std 9
10 μL std 10 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)
40000
10000
Std 8
10 μL std 9 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)
13333.3
3333.33
Std 7
10 μL std 8 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)
4444.4
1111.11
Std 6
10 μL std 7 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)
1481.5
370.37
Std 5
10 μL std 6 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)
493.8
123.46
Std 4
10 μL std 5 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)
164.6
41.15
Std 3
10 μL std 4 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)
54.9
13.72
Std 2
10 μL std 3 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)
18.3
4.57
Std 1
10 μL std 2 + 20 μL 检测缓冲液(含1.2% DMSO)
6.1
1.52
0
20μL 检测缓冲液
0
0
实验流程
将试剂配制后,轻柔混匀备用,按照下表进行加样。
标准品
待测样品
阴性对照
Step1
5 μL Tag1-CRBN/DDB1
5 μL
检测缓冲液Step2
5 μL
稀释后的标准品5 μL
待测样品(4X)5 μL
检测缓冲液离心
封板,1000rpm,离心1min混匀,
室温孵育30minStep3
10μL Thalidomide-Ac + Anti-Tag1-Eu 1:1 Mix
读板
封板,1000rpm,离心1min混匀,
室温孵育120min,读板*孵育时用封板膜封板,防止试剂蒸发。
数据处理
计算每个孔位的受体和供体的发射信号的比值:
Ratio=(Signal 665nm/Signal 620nm)×104
计算CV(%):CV(%)=Ratio Deviation/Mean Ratio×100%
- 产品数据
生物活性
(1)标准曲线*
由图表可知,由于Thalidomide标准品与Thalidomide-Ac竞争与CRBN/DDB1的结合,使信号值降低。(2)结合活性和抑制剂验证
Thalidomide-Ac与CRBN/DDB1结合验证,由结果可知,蛋白浓度不变时,检测信号随着Thalidomide-Ac浓度的升高而增加。Lenalidomide和Pomalidomide以及PROTAC BET Degrader-1可以竞争Thalidomide-Ac与CRBN/DDB1的结合。
| 货号 | 产品名称 | 种属 | 表达系统 | 数量 |
|---|
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