1、细胞培养
用5 µg/ml CD3 抗体包被96孔细胞培养板过夜，第二天洗板封闭后加入用CD4 Nanobeads, human（S0B5740）分选后的CD4+ T细胞，培养基用RPMI-1640 加100 ng/ml IL-6, 50 ng/ml IL-21, 10 μg/ml anti-IFN-γ, 10 μg/ml anti-IL-4抗体10 ng/mL TGF-β, 55 μM β-巯基乙醇，1 µg/ml CD28抗体及10 % FBS培养， 48 小时开始每 12 小时观测细胞浓度，如果细胞密度很大，则将细胞分到新的孔中，并加以上培养液刺激（不用添加CD3,CD28抗体刺激），培养5天后收集细胞细胞，将胞密度控制为10⁶/ml，用10ng/ml PMA+1μg/ml
Ionomycin
，10μg/ml Brefeldin A共处理5h。
阴性对照组Th0细胞: 用5 µg/ml anti-human CD3 mAb包被96孔细胞培养板过夜，第二天洗板封闭后加入分选后的CD4+ T细胞, 培养基用RPMI-1640 加 10 % FBS, 55 μM β巯基乙醇, 10μg/mL Anti-human IL-4, 10μg/mL Anti-Human IFN-γ, 200U/ml IL-2 , 1 µg/ml anti-human CD28 mAb培养，48 小时开始每 12 小时观测细胞浓度，如果细胞密度很大，则将细胞分到新的孔中，并加以上培养液刺激（不用添加CD3,CD28抗体刺激）培养5天。
2、流式检测
收集细胞后用流式检测抗体染色上机
抗体货号 starter S0B5348 Alexa Fluor® 647 Mouse Anti-Human CD279 (PD-1) Antibody
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营业执照（三证合一） 
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