Naïve CD4⁺ T细胞的Tfh极化诱导

1 包被抗CD3ε/CD28抗体以激活T细胞

1.1使用无菌PBS将抗小鼠CD3ε单克隆抗体和抗小鼠CD28单克隆抗体分别稀释至工作浓度（10 µg/mL和2 µg/mL）。

1.2向48孔细胞培养板的每孔加入500 µL上述抗体混合液，确保液体覆盖孔底。

1.3将培养板置于4°C冰箱中，包被过夜（约16-18小时）。

2 接种细胞并启动Tfh极化

2.1次日，吸弃孔内包被液，用预冷的无菌PBS轻柔洗涤孔板两次，以去除未结合的抗体。

2.2将经CD4⁺ T细胞分选磁珠分选获得的、纯度>95%的小鼠脾脏Naïve CD4⁺ T细胞，以 4−5×10⁵cells/mL的浓度重悬于Tfh极化完全培养基中。

Tfh极化完全培养基配方：RPMI-1640基础培养基，补充10%胎牛血清、55 µM β-巯基乙醇、100 ng/mL重组小鼠IL-6、50 ng/mL重组小鼠IL-21、30 ng/mL重组小鼠TGF-β1、10 µg/mL抗小鼠IFN-γ功能性抗体、10 µg/mL抗小鼠IL-2功能性抗体及10 µg/mL抗小鼠IL-4功能性抗体。

2.3取500 µL细胞悬液接种至已包被的48孔板的每个孔中。置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中培养。

3 培养维持与细胞扩增

3.1培养48小时后，轻柔吹打并收集细胞悬液，300 ×g离心5分钟。

3.2弃上清，用新鲜的Tfh极化完全培养基将细胞重悬，并将细胞密度调整至 1×10⁶ cells/mL，重新接种至新孔板中继续培养。

3.3此后，每12小时在倒置显微镜下观察细胞密度及状态。若细胞密度过高（例如 >2×10⁶ cells/mL），则进行半量换液或按适当比例将细胞分至新的孔中，并补充新鲜Tfh极化完全培养基，以维持细胞最佳生长状态。

4 细胞再刺激与胞内因子捕获

培养至第5天，收集细胞，用预冷的PBS洗涤一次后，使用含有 10 ng/mL PMA、1 µg/mL Ionomycin及10 µg/mL Brefeldin A 的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，调整密度至 1×10⁶cells/mL，于37°C、5% CO₂培养箱中避光共刺激孵育5小时。

阴性对照组（Th0）设置

为评估极化的特异性，平行设置Th0阴性对照组。其流程与上述上述Tfh诱导组基本相同，主要区别在于：

1.使用不同的维持培养基：使用Th0维持培养基，其组成为RPMI-1640基础培养基，补充10%胎牛血清、55 µM β-巯基乙醇、10 µg/mL抗小鼠IFN-γ及10 µg/mL抗小鼠IL-4中和性抗体。

2.不添加极化细胞因子：该培养基中不添加极化细胞因子。

除上述培养基差异外，细胞接种、换液、密度监控及第5天的再刺激步骤均与Tfh诱导组相同。

流式细胞术检测
1. 收集细胞：收集细胞，用PBS清洗细胞1遍，弃上清，再将细胞用PBS轻轻吹打重悬；

2. 计数：用细胞计数仪计数并计算细胞总数，并将按照1*10^7/ml重悬；

3. 细胞封闭：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300×g 离心5min，弃上清；

4. 孵育抗体：每孔加入100μl 10%FBS的PBS，并加入孵育抗体APC Rat Anti-Mouse PD-1 Antibody（Starter S0B5654） (抗体用量参考说明书）;

5. 洗涤细胞：用PBS洗涤细胞，去除残留的抗体，并再次用PBS重悬；

6. 死活染料染色：每孔加入7-AAD (BD 559925)，室温避光孵育5min；

7. 上机检测。

小鼠Tfh 极化套装