1、细胞培养
用10 µg/ml anti-mouse CD3ε mAb和2 µg/ml anti-mouse CD28 mAb包被48孔细胞培养板过夜，第二天洗板封闭后加入CD4 Nanobeads（
S0K0003
）分选后的CD4+ T细胞，培养基用RPMI-1640 加100 ng/ml IL-6, 50 ng/ml IL-21, 30 ng/mL TGF-β1, 10 μg/ml anti-IL-2, 10 μg/ml anti-IFN-γ,10 μg/ml anti-IL-4, 55 μM β-巯基乙醇及10 % FBS培养, 48 小时开始每 12 小时观测细胞浓度，如果细胞密度很大，则将细胞分到新的孔中，并加以上培养液刺激（不用添加 anti-mouse CD3ε和anti-mouse CD28 mAb刺激），培养5天后收集细胞细胞，将胞密度控制为10⁶/ml，用10ng/ml PMA,1μg/ml Ionomycin，10μg/ml Brefeldin A共处理5h。
阴性对照组Th0细胞：用10 µg/ml anti-mouse CD3ε mAb和2 µg/ml anti-mouse CD28 mAb包被48孔细胞培养板过夜，第二天洗板封闭后加入分选后的CD4+ T细胞，维持培养基为RPMI-1640 加 10 % FBS, 55 μM β巯基乙醇，10μg/mL anti-mouse IFNγ，10μg/mL anti-mouse IL-4 培养，48 小时开始每 12 小时观测细胞浓度，如果细胞密度很大，则将细胞分到新的孔中，并加以上培养液（不用添加 anti-mouse CD3ε和anti-mouse CD28 mAb）培养5天。
2、流式检测
收集细胞后用流式检测抗体染色上机
S0B5654 starter APC Rat Anti-Mouse PD-1 Antibody
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