Stomach organoids Cytokine Set, Human/人胃类器官细胞因子套装

所需试剂：

配置DE诱导培养基

配置球状体生成培养基

配置hAGOs形成培养基

GM培养基：DMEM/F12, 1x N2, 1xB27(不含VA), 2mM L-谷氨酰胺, 15mM HEPES, 1x penicillin-streptomycin.

培养流程：

一、hPSC细胞消化并传代

1、将hPSCs培养至融合度约为75-85%，且大部分无分化状态时，吸出培养基，加D-PBS洗一遍，吸出后加入1 ml Accutase，并将培养皿放回37℃，5% CO2的组织培养箱中，直到所有的细胞都以小细胞块的形式解离 (通常需要5-7分钟)。

2、消化完成后，加入1ml mTeSR1培养基，轻轻吹下细胞，收集细胞转移至15ml离心管中，室温下300g离心3min。

3、吸出上清，加1ml mTeSR1培养基重悬细胞，按1:10的比例传代。

4、将细胞接种在已包被Matrigel的6孔板中，每孔加3ml mTeSR1培养基（含有10 μM ROCK inhibitor Y-27632），轻轻晃匀，放置在37℃，5% CO2的组织培养箱中培养。

二、hPSCs分化为定型内胚层DE(第0-2d)

1、显微镜下观察状态，待hPSCs单层汇合度达到75-90 %，记为Day0。吸弃 mTeSR1培养基，换DE诱导培养基，培养48 h，每24 h换液一次（配方按时间轴执行）。Day1-Day2 可见成片漂浮碎片，网状连接仍存在。

2. DE诱导满48 h后，单层汇合度升至95-100 %，界面致密几乎无空隙。

三、后前肠球状体的自发出芽（第3-5天）

1、弃去旧液，换用球状体诱导培养基，继续静置培养48 h，每24 h换液一次（配方严格按时间轴配制）。

2、第4天即可见孔底出现前球体样3D微结构。

3、在第5天可见密集出芽的3D球体，伴少量游离细胞团。

注意：第5天培养基含视黄酸（RA），操作前关闭安全柜照明，并用铝箔包裹培养基瓶及RA管，避免光解。

4、在第6天，后前肠球状体大量悬浮，即可收集。

5、小心吸出后前肠球状体，并收集到离心管。

四、球状体发育成hAGOs（第6-20天）

1. 提前一日将Matrigel置于4 °C过夜，缓慢融化。

2. 把装有后前肠球状体的离心管垂直插入管架，静置约 10 min，借重力让球体自然沉底，无需离心。

3. 吸尽上层培养液后，沿管壁迅速加入适量预冷Matrigel，轻缓吹打2-3次混匀，避免气泡。

4. 取 50 μl 混合液，滴于24孔板孔中央；移液器吸头略高于底面，勿触碰孔壁，确保液滴圆润。

5. 将板放入 37 °C、5 % CO₂ 培养箱，静置20min 使Matrigel完全凝固；随后每孔沿壁缓缓加入700 μl hAGOs形成培养基，完全覆盖胶滴。

6. 自接种日起，每2-3天换液一次：若酚红指示变黄，或实验方案需调整生长因子，则立即更换新鲜 hAGOs 形成培养基，持续至第20天。

五、hAGOs传代—维持长期扩增

1、第20天前后，把hAGOs重新包埋于新鲜Matrigel，降低单孔密度，避免过度融合。

2、弃去旧培养基，沿壁加入少量预冷DMEM/F12，维持胶体湿润。

3、置于体视显微镜下，用解剖刀环绕 hAGOs 将Matrigel切成小片，每片含5–10个类器官；刀口避开类器官本体，多数受损单位可再封闭腔室并继续增殖。

4、按步骤四重新接种、固胶、加液，完成传代，进入下一轮培养周期。

避免涡旋振荡；分装保存减少冻融次数