NHS-Activated Beads

2.1 缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤。

清洗液：1 mM HCl

偶联液：0.2 M NaHCO3，0.5 M NaCl，pH8.0

封闭液：0.5 M 乙醇胺，0.5 M NaCl，pH8.3 或 0.1 M Tris，pH8.5

清洗液 1：0.1 M 乙酸-乙酸钠，0.5 M NaCl，pH3.0

清洗液 2：0.1 M Tris-HCl，0.5 M NaCl，pH8.0

保护液：含 20%乙醇的 1XPBS

注：1.偶联液可以选择碳酸盐、磷酸盐等不含氨基的缓冲液体系。缓冲液体系中加入一定浓度的盐离子减少非特异性吸附。

2. 当偶联样品为抗体时，可选择 1XPBS，0.02%NaN3或者 1XPBS，0.02%Proclin 300 作为保护液。

2.2 样品准备

样品用偶联液溶解或透析，浓度约 5-10 mg/ml。

2.3 样品偶联

下面以偶联抗体纯化抗原为例，介绍偶联及后续纯化步骤。

1) 取适量的 NHS- Activated Beads，用清洗液抽滤清洗三次，用偶联液清洗一次。注：填料不可抽太干，以免结块，万一出现结块

现象可振荡或吹打分散开。可以选用预冷的溶液快速清洗，减少预活化介质的水解。

2) 溶解好的样品加入至清洗好的 NHS- Activated Beads 中，NHS- Activated Beads ：样品溶液体积比约 1：1-2（V/V）。

3) 28℃振荡反应 2-4 h 或 4℃过夜。注：确保填料悬浮起来，否则会大大影响偶联效率。

4) 反应完后收集偶联样品，以便检测偶联效率。去离子水清洗填料，加入 2 倍柱体积的封闭液，28℃振荡反应 1 h。

注：偶联后无法用紫外吸收测定上清蛋白浓度，建议用电泳或者 BCA 定量法检测偶联效率。

5) 将上述反应体系取出，流干其中的封闭液，用 3 倍柱体积的去离子水清洗填料，清洗液 1、去离子水、清洗液 2 和去离子水重复冲洗 2

次，然后保存在等体积的保护液中，于 2-8℃保存。

2.4 层析柱的装填

2.4.1 重力柱的装填

1）取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。

2）将偶联好的填料混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中，打开下出口流干保护液。

3）加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。

4）装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。

5）装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡。

2.4.2 中压层析柱的装填

偶联好的填料也可用于大体积样品的纯化，因此，涉及到各种中压色谱层析柱的填装，下面介绍使填装层析柱的方法。

装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需介质体积，公式如下：

V：所需介质体积 ml

1.15：压缩系数

r：柱管半径 cm

h：装填高度 cm

注意：所取悬液体积应为介质体积的两倍，因为介质体积只占悬液总体积的一半，另一半为保护液。

1) 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出 1-2 cm 的去离子水。

2) 将填料悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3) 如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。

4) 打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液

压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用你所使用泵的最大流速，这样也可以得到

一个很好的装填效果。（注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的 75%）当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上

3 倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。

5) 关闭泵，关闭层析柱出口。

6) 如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。

7) 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。

8) 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

2.5 样品纯化

2.5.1 缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤。

平衡/ 洗杂液：0.15 M NaCl，20 mM Na2HPO4，pH 7.0

洗脱液：0.1 M 甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

2.5.2 孵育法纯化

1）根据纯化的样品量，取适量偶联好的填料加入层析柱中，重力流干保护液。

2）加入 5 倍介质体积的平衡液清洗介质，重力流干。

3）加入样品，封闭柱管两端，4℃振荡孵育 2-4 h 或者 37℃孵育 30 min-2 h。

4）孵育结束后，离心或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。

5）用 5 倍介质体积的洗杂液清洗介质，离心或过滤去除上清，重复 3-5 次，中间建议更换新离心管。

6）加入 3-5 倍柱体积的洗脱液进行洗脱，孵育 10-15 min，离心或过滤收集洗脱液，可重复 2-3 次。洗脱组分需要立即调成中性，一般建

议使用洗脱组分体积 1/10 的中和液进行中和。

2.5.3 重力柱法纯化

1）将装填好的重力柱用 5 倍柱体积平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下。

2）将样品加到平衡好的重力柱中，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。

3）用 10 倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4）使用 5 倍柱体积的洗脱液洗脱，分管收集。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积 1/10 的中和液进行中和。

2.5.4 中压层析柱法纯化

中压层析柱装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。

1) 将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。

2) 用 3-5 倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。

3) 使用至少 5 倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。

4) 利用泵或样品环上样。

注：样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成

很大的反压，使得进样器更难使用。

5) 用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少 10-15 个柱体积）。

6) 使用 5-10 倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。洗脱组分需要立即调成中性，一般建议使用洗脱组分体积 1/10 的中

和液进行中和。

介质洗脱结束后，用平衡液冲洗 5-10 柱体积，然后用纯水冲洗 5-10 个柱体积，再用 20%乙醇冲洗 2 个柱体积，置于 2-8℃保存。

2.6 SDS-PAGE 检测

将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用 SDS-PAGE 检测纯化效果。