一、引言

    

二、泛素 - 罗丹明 110 的分子设计与检测原理

     

（一）分子结构特征

（二）荧光检测机制

三、在 USP1 活性检测中的核心应用

（一）体外酶学特性研究

 

动力学分析显示，USP1-UAF1 复合物对探针的切割效率（kcat/Km）显著高于单独 USP1，证实 UAF1 的激活作用；

点突变实验中，C90（催化三元组关键残基）突变后荧光信号几乎完全消失，直接验证催化核心的必要性。

（二）细胞内活性可视化

 

在 HeLa 细胞中，荧光信号主要富集于细胞核（与 USP1 的核定位一致）；

紫外线诱导 DNA 损伤后，核内荧光强度 1 小时内提升 2.3 倍，提示 USP1 活性被激活以参与 DNA 修复；

USP1 敲除细胞中荧光信号降低 72%，证实探针的特异性。

   

四、技术优势与局限性

（一）显著优势

高灵敏度与特异性：检测限达纳摩级，泛素部分确保仅响应 DUBs，对其他蛋白酶无交叉反应；

实时动态监测：荧光信号随酶切反应实时变化，可获取动力学参数，优于 Western blot 等终点检测法；

高通量兼容性：适用于 96/384 孔板体系，无需放射性标记，可快速筛选抑制剂。

（二）现存局限

底物模拟限制：单泛素结构无法完全模拟多泛素链或泛素化靶蛋白的天然构象，可能影响部分 DUBs 的识别效率；

细胞递送挑战：未经修饰的探针膜穿透性差，化学修饰（如 PEG 化）可能降低其与酶的结合活性；

复杂体系干扰：血清或细胞裂解液中的成分可能淬灭荧光，需优化缓冲体系以降低背景。

   

五、在药物研发中的应用价值

    

 

在体外筛选中，通过监测荧光强度变化可快速评估化合物的抑制活性，如对 KSQ-4279（USP1 变构抑制剂）的 IC50 测定显示，其半数抑制浓度与细胞实验结果偏差小于 15%；

结合荧光偏振技术可区分抑制剂作用模式（竞争性 / 非竞争性），为构效关系分析提供依据；

细胞水平实验中，修饰后的探针可验证抑制剂的胞内活性，如候选化合物处理后，肿瘤细胞内荧光信号降低幅度与抑制剂浓度呈线性相关，为体内实验提供前期数据。

   

六、总结与展望