杆状病毒滴度检测：生物制品生产的 “活性标尺” 与质控关键

一、引言

二、杆状病毒滴度检测的技术背景

（一）滴度检测的必要性

          

重组病毒筛选：验证纯化后病毒活性，排除缺陷病毒；

病毒扩增：监测 BV 增殖效率，确保滴度达 10⁶~10⁸ PFU/mL，满足大规模感染需求；

细胞感染：依据滴度计算 MOI（感染复数）——MOI 过高致细胞过早裂解，过低则降低蛋白表达效率，精准控制比例是工艺稳定的核心。

（二）宿主细胞与检测的关联性

        

Sf9 细胞：对 AcNPV 敏感性高，贴壁生长时形态规则，是病毒扩增与滴度检测首选；

Sf21 细胞：直径大于 Sf9，空斑更易观察，适合精细化检测；

Hi5 细胞：更适分泌型蛋白表达，对杆状病毒敏感性较低，较少用于滴度检测。

         

三、杆状病毒滴度检测的常用方法

（一）空斑形成实验：“金标准” 检测

     

对数期 Sf9 细胞铺板（2×10⁵ cells/mL），贴壁 4~6 小时形成单层；

病毒液 10 倍梯度稀释（10⁻²~10⁻⁸），每稀释度 3 个重复孔，每孔加 100~200 μL 病毒液，37℃孵育 1 小时；

吸除病毒液，加 40℃低熔点琼脂糖培养基，凝固后 27℃培养 5~7 天；

计数 10~100 个空斑的稀释度，按 “滴度 = 空斑数 × 稀释倍数 / 感染体积” 计算。

      

（二）终点稀释法：半定量替代方案

     

Sf21 细胞铺 96 孔板（1×10⁴ cells / 孔），贴壁 24 小时；

病毒液 2 倍或 10 倍稀释（10⁻¹~10⁻¹²），每稀释度 8~12 复孔，加 100 μL / 孔；

27℃培养 7~10 天，记录 CPE 孔数；

用 Reed-Muench 法计算 TCID₅₀，按 “1 TCID₅₀≈0.7 PFU” 换算。

     

（三）快速检测技术：效率升级方案

免疫荧光法（IFA）：感染后 24~48 小时，用抗病毒结构蛋白抗体（如抗 Polh 抗体）结合荧光二抗，计数阳性细胞推算滴度。周期缩至 2~3 天，灵敏度高，但需特异性抗体，成本较高；

实时定量 PCR（qPCR）：检测病毒保守基因（如 Polh、p10）拷贝数，结合换算系数（1×10⁶拷贝≈10³~10⁴ PFU）得活性滴度。6 小时内完成，通量高，但无法区分活性与非活性病毒，需结合传统方法验证。

       

四、滴度检测在生物制品质控中的应用

（一）生产工艺控制

rAAV 载体生产：需 BV 滴度达 10⁷ PFU/mL 以上，才能实现 Sf9 细胞高效包装（产量 10¹⁴ VG/L）；

亚单位疫苗生产：如 FluBlok® 生产中，依滴度控制 MOI（5~10），确保 Sf9 细胞高效表达 HA 蛋白；

重组蛋白生产：根据滴度调整感染时间，避免细胞过早裂解影响蛋白分泌。

（二）宿主残留风险管控

五、总结与展望