透明质酸酶（Hyaluronidase, HAase）是一类特异性降解透明质酸（HA）及部分糖胺聚糖的糖苷酶，通过切割 β-1,4 糖苷键将大分子底物分解为小分子片段（图1）。这一特性使其成为生物医药领域的关键工具：作为药物辅剂，可破坏细胞外基质 HA 结构，提升共注射药物的组织通透性，加速吸收；在临床中，用于眼科手术防黏连、整形外科缓解 HA 填充并发症，还能作为抗肿瘤佐剂提高皮下注射药物剂量，增强疗效(图2）。
自 20 世纪 50 年代商业化以来，透明质酸酶的发展始终依赖下游纯化工艺的革新。从早期动物组织提取到如今重组蛋白生产，工艺升级直接推动产品纯度、安全性与规模化能力的提升，成为其广泛应用的核心支撑。
图1. 透明质酸酶rHuPH20切割β1-4糖苷键
图2. 透明质酸酶作为皮下注射药物辅料，可以催化细胞外基质中透明质酸的降解，从而允许大容量皮下注射，增加共给药蛋白质的分散和吸收
早期透明质酸酶主要从牛、羊睾丸组织提取，这类原料 HAase 含量高、活性稳定。纯化以两步亲和层析为核心：第一步用 Blue Sepharose Fast Flow 填料，通过疏水作用与核酸亲和性去除大部分杂蛋白与核酸；第二步用 Capto Lentil Lectin 填料，利用其对 HAase 糖基的特异性结合，实现目标蛋白富集。
SDS-PAGE 与 Western blot 验证显示，该工艺可分离出活性 HAase（如牛源样品经 Capto Lentil Lectin 洗脱后呈单一目标条带），但存在显著缺陷：产品纯度低，残留动物蛋白酶、免疫球蛋白等杂质，易引发人体过敏；原料供应受养殖周期、疾病影响，难以规模化；动物组织可能携带病原体，存在生物安全风险。这些问题推动技术向重组蛋白方向转型。
重组人 PH20（rHuPH20）是目前应用最广的透明质酸酶，天然存在于人类精子中，中性与酸性环境下均有活性，半衰期短、静脉注射安全，是高浓度药物皮下注射的理想佐剂。其主流表达系统为 CHO 细胞，下游纯化以多步层析组合为基础，通过离子交换、疏水、糖基亲和层析联用，可使产品纯度超 90%，比活达 100,000 USP Units/mg 以上，HCP 残留＜1%，内毒素＜0.5 EU/mg，满足临床标准。
为简化流程，His 标签技术成为关键：His 标签分子量仅 0.8 kDa，远小于 GST 标签（26 kDa），对 rHuPH20 结构与活性影响极小。带有 His 标签的 rHuPH20 可通过 IMAC 层析纯化，用 HisTrap HP 预装柱，以 35 mM 咪唑缓冲液结合、200 mM 咪唑洗脱，高效捕获目标蛋白。将 “阴离子层析（Q Sepharose 柱，0-100% NaCl 线性洗脱）+His 标签亲和层析” 联用，还可纯化出用于晶体结构解析的高纯度 rHuPH20。
针对商业化需求，Cytiva Protein Select 填料展现显著优势：通过标签自裂解机制，单一步骤完成 rHuPH20 捕获与标签切除，无需额外酶切；蛋白载量达 20 g/L，经 50 次再生仍稳定，且可从实验室小试无缝过渡到工业生产，适配细菌、哺乳动物等多种表达系统，为规模化生产提供高效方案。
图3. 重组透明质酸酶获取流程（A）从自然资源或数据库中挖掘新型透明质酸酶；（B）解码新型透明质酸酶序列；（C）实现高水平的重组透明质酸酶生产
为确保产品安全有效，需严格控制三大关键属性：
纯度与活性：用 SDS-PAGE、HPLC 验证纯度，USP 底物法测定比活，保障活性稳定；
杂质清除：ELISA 测 HCP 残留，鲎试剂法测内毒素，PCR 法控宿主 DNA，避免不良反应；
结构完整：圆二色谱分析二级结构，质谱验证分子量与糖基化修饰，确保与天然蛋白一致。
透明质酸酶纯化工艺实现了从 “动物提取” 到 “重组生产” 的跨越，通过多步层析、标签技术与新型填料的应用，解决了传统工艺的纯度与安全问题。未来，随着连续层析、高通量筛选技术的发展，工艺将进一步向高效化、低成本化升级，为透明质酸酶在医学、美容等领域的广泛应用奠定更坚实的技术基础。
营业执照（三证合一） 