LCMV MHC四聚体：追踪病毒特异性T细胞应答的金标准

一、小鼠模型：如何在动物研究中模拟T细胞耗竭？

小鼠模型是研究T细胞耗竭最早建立且应用最广泛的系统。尤其是淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）克隆13株感染模型，被公认为研究T细胞耗竭的“金标准”。该模型最早由Moskophidis等人在1993年提出，他们发现持续性的病毒感染会导致CD8⁺ T细胞逐渐丧失效应功能，并高表达抑制性受体。

在这一模型中，研究者通常需将表达特定T细胞受体（TCR）的转基因T细胞（如OT-I或P14细胞）过继转移至感染小鼠体内，再在不同时间点（例如感染后8至30天）从脾脏、淋巴结或血液中分离T细胞，进行表型与功能分析。利用荧光标记的MHC四聚体（如H-2Dᵇ/gp33四聚体），可以精确识别并分选病毒特异性的CD8⁺ T细胞，从而分析其耗竭相关分子的表达及功能变化。

尽管如此，该模型仍存在一些局限性。实验周期长（通常需一个月），获得的细胞数量有限（通常需合并多只小鼠的细胞），且物种差异使得结果向临床转化存在挑战。此外，小鼠模型虽可用于机制探索（如利用基因敲除鼠研究特定分子通路），但由于体内微环境复杂，很难完全解析导致T细胞耗竭的因果关系。

二、人体组织分离：如何直接从患者样本中研究耗竭T细胞？

直接从慢性感染或肿瘤患者的组织中分离T细胞，是研究人体内T细胞耗竭的重要途径。早在1999年，研究者就分别从HIV、HCV等慢性病毒感染患者以及黑色素瘤、卵巢癌等肿瘤组织中鉴定出表型耗竭的T细胞。这些细胞普遍高表达PD-1、CTLA-4等抑制性受体，且在体外再刺激时产生细胞因子的能力显著下降。

技术上，通常需将组织样本机械消化为单细胞悬液，之后通过流式细胞术或磁珠分选获取目标T细胞群体。若已知T细胞针对的抗原表位，还可借助MHC四聚体富集抗原特异性T细胞，从而实现更高精度的分析。

人体组织模型的突出优势在于其真实的病理背景，能够反映局部微环境对T细胞状态的影响。然而，该方法也面临样本可及性低、来源不稳定等挑战。更重要的是，由于伦理和技术限制，我们无法在人体内进行干预或追踪实验，因此难以建立因果关系。近年来，结合患者来源的类器官共培养系统，使得在近似生理环境中研究人T细胞耗竭成为可能，为这一领域带来了新的机遇。

三、体外T细胞耗竭模型：如何通过人工刺激模拟耗竭状态？

为克服体内模型的复杂性和样本限制，研究者开发了多种体外诱导T细胞耗竭的方法。这些模型通常基于持续性的TCR刺激，旨在模拟慢性抗原暴露导致的T细胞功能失调。

1. 抗体刺激模型：
最常用的方法是以包被抗CD3/抗CD28抗体的磁珠或平板持续刺激T细胞。例如，Balkhi等人（2018）通过8天的磁珠刺激人外周血CD4⁺和CD8⁺ T细胞，成功诱导出PD-1、LAG-3、TIM-3等高表达、细胞因子分泌减少的耗竭表型。此后，Corselli等人（2022）进一步优化实验方案，延长刺激时间至14天，并结合单细胞多组学分析（如表面蛋白检测与靶向RNA测序），全面描绘了T细胞在耗竭过程中的分子变化。

该方法的优势在于操作简便、细胞产量大、重复性好，适用于高通量筛选或机制研究。但需注意过度刺激可能引发细胞凋亡，需在实验中设置适当对照或通过分选去除死细胞。

2. 抗原特异性刺激模型：
为更贴近生理激活，一些研究采用抗原肽段或靶细胞刺激T细胞。例如，用OVA肽段体外刺激OT-I转基因CD8⁺ T细胞，5天后可观察到IFN-γ、TNF-α分泌减少，同时耗竭标志物上升，并出现与终末耗竭T细胞一致的表观遗传特征（如TCF-1下调、TOX上调）。

此类模型虽更接近体内激活方式，但仍需结合MHC四聚体等技术确认T细胞的特异性与纯度，以避免非特异激活带来的干扰。

四、讨论：如何选择合适的研究模型？三种方法各有什么优劣？

选择研究模型需综合考虑科学问题、技术可行性与转化价值。

小鼠模型 适合机制探索和干预研究，尤其在转基因动物中可进行精准的体内跟踪，但物种差异和周期长度是其主要限制。

人体组织模型 提供最接近真实疾病的状态，适用于生物标志物挖掘和微环境研究，但样本获取困难，且难以进行因果推断。

体外模型 具有可扩展、可控性强的优点，适用于高通量筛选或分子机制研究，但其能否完全模拟体内耗竭状态仍需验证。

值得注意的是，无论哪种模型，MHC四聚体技术都发挥着关键作用——它使研究者能够精确识别、追踪和分析抗原特异性T细胞，从而更准确地揭示T细胞耗竭的动态过程。

五、总结与展望

T细胞耗竭研究依赖于多种互补的模型系统。从LCMV感染小鼠到患者肿瘤样本，再到体外刺激系统，每种方法都为理解T细胞功能障碍提供了独特视角。未来研究应注重整合多种模型，并结合单细胞多组学、表观遗传分析等新技术，从而更全面揭示T细胞耗竭的调控机制，为免疫治疗策略的开发提供坚实理论基础。