基于荧光素酶的细胞株工程技术：原理及在生物医学研究中的应用

Q1：使用荧光素酶标记肿瘤细胞株进行体内研究的基本原理是什么？

活体成像技术能够无创、实时地观察活体动物体内的肿瘤生长、转移及基因表达等生物学过程。在多种成像技术（如超声、CT、MRI、PET）中，基于荧光素酶（Luc）的生物发光成像（BLI）具有独特优势。荧光素酶在氧气和ATP存在条件下，可催化底物荧光素（luciferin）发生氧化反应，产生可检测的光信号，无需外部激发光。该反应仅发生于活细胞内，发光强度与细胞数量呈线性关系。由于红光（>600 nm）不易被血红蛋白吸收，光子能够穿透组织，被高灵敏度制冷CCD相机捕获，从而实现体内肿瘤负荷的精确量化。

Q2：荧光素酶的表达是否会改变细胞自身功能？

大量研究证实，荧光素酶的表达不会干扰细胞正常的生理活动，包括增殖、迁移或信号转导。其稳定基因组整合保障了表达在代际间的持续性，是一种可靠的长期研究工具。

 

Q3：荧光素酶标记细胞株的稳定性如何？是否需要进行抗生素筛选？

若荧光素酶基因已稳定整合于基因组中，其表达在细胞分裂和分化过程中仍能保持一致。虽然短期培养不一定需要抗生素加压，但长期传代可能导致转基因沉默或丢失。建议定期施加抗生素压力或从原始库存重新培养细胞，以维持信号强度。

 

Q4：为什么体内信号可能出现微弱或无法检测？
以下因素会影响信号检测：

仪器灵敏度：高性能制冷CCD相机和遮光良好的成像暗箱是捕获弱光信号的关键。

底物动力学：腹腔注射荧光素后约10–20分钟信号达到峰值，持续约30分钟；静脉注射起效更快但持续时间较短。标准剂量为150 mg/kg。

细胞位置与数量：信号强度每深入1厘米约衰减10倍。皮下移植可能只需数百个细胞，而深部病灶需更多细胞。

底物质量：应通过标准曲线验证不同批次的荧光素，以确保达到饱和动力学。

 

Q5：体外荧光素酶检测常见的注意事项有哪些？

时间控制：加入底物后荧光素酶活性每30分钟衰减一半，需尽快完成检测。

微孔板选择：白色不透明板可减少孔间干扰；黑色板会吸收信号，降低灵敏度。

底物保存与使用：荧光素需避光保存于–20°C，且应使用饱和浓度以确保检测准确性。

 

Q6：为何小鼠成像前需进行脱毛处理？

毛发会阻挡、吸收及散射光线，并产生强烈自发荧光。脱毛操作可显著降低背景噪声，提高信噪比。

 

Q7：能否可靠检测深部组织信号？

尽管信号强度随深度呈指数衰减，荧光素酶成像仍适用于皮下及多数原位模型。在小鼠中，光信号可穿透3–4厘米，足以满足大多数临床前研究需求。

 

Q8：除肿瘤研究外，荧光素酶技术还有哪些应用？
该技术具有广泛用途：

干细胞追踪：在再生医学研究中监测细胞迁移与定植。

感染模型：标记病原体（如细菌）以研究宿主-病原体互作。

基因调控：实时报告启动子活性或蛋白质相互作用。

药物筛选：通过动态读取细胞反应来评估化合物效果。

 

Q9：高质量的荧光素酶标记细胞株应具备哪些特征？
理想细胞株应满足：

稳定基因组整合：保障代际间表达一致性。

功能验证：经过STR鉴定、物种验证及荧光素酶活性检测。

无支原体污染：确保体内外实验结果可重复。

高信号强度：支持高灵敏度的体内外检测。

示例验证：

以荧光素酶/GFP双标记的胰腺导管腺癌细胞株（如PANC02-Luc/GFP）为例，可通过生物发光（定量）和荧光（定位）实现多角度监测，为实验设计提供更大灵活性。