明辨“红”与“深红”：pH敏感抗体标记试剂如何选择

在细胞生物学与免疫学研究中，追踪抗体在活细胞内的内化过程至关重要。传统的标记方法往往面临高背景荧光的干扰，而pH敏感标记技术的出现，革命性地解决了这一问题。其中，pH-sensitive IgG labeling reagents (Deep Red) 与pH-sensitive IgG labeling reagents (Red)是两个最常用的明星产品。尽管它们名称相似，但在实际应用中却有着明确的区分。本文将深入剖析两者的核心区别，助您为实验做出最佳选择。

 

一、核心共同原理：智能“点亮”的荧光探针

 

首先，理解它们的共同工作机制是区分的基础。这两种试剂都是与IgG抗体共价偶联的荧光染料，其最核心的特性是 pH敏感性：

 

在中性或碱性pH下（如细胞外环境，pH ~7.4）：染料处于淬灭状态，几乎不发出荧光。这意味着未被内化的抗体不会产生背景信号，极大地提高了信噪比。

 

在酸性pH下（如内吞体/溶酶体内，pH ~5.0-6.0）：染料的荧光基团被质子化，结构发生变化，从而“点亮”发出强荧光。

 

 

因此，当用这些试剂标记的抗体与细胞表面抗原结合后，只有那些被细胞吞噬并进入酸性细胞器（内体、溶酶体）的抗体才会发出荧光。通过荧光显微镜或流式细胞术，研究人员可以精确地观察和定量抗体的内化过程。

 

二、核心差异：组织穿透性与自发荧光

 

特性	pH-sensitive IgG labeling reagents (Red)	pH-sensitive IgG labeling reagents (Deep Red)
激发/发射波长	约 560/585 nm	约 640/660 nm
常用激光器	绿光激光器 (如 532 nm, 561 nm)	红光激光器 (如 633 nm, 640 nm)
流式检测通道	通常为PE通道或Texas Red通道	通常为APC通道或Cy5通道
颜色	亮红色	远红色/红外边缘
自发荧光	较高（细胞在红色区域有一定自发荧光）	极低（细胞和组织在此区域自发荧光很少）
组织穿透性	较弱	较强
多色搭配	容易与FITC, Pacific Blue等多色搭配	非常适合多色实验，是高端多色面板的关键颜色

 

三、pH-sensitive IgG labeling reagents (Red)和pH-sensitive lgG labeling reagents (Deep Red)的抗体孵育方案

 

pH-sensitive lgG labeling reagents (Deep Red)以优爱生物UA079026 举例

 

1.1 UA079026与抗体孵育

 

1.2 使用去离子水，将冻干粉形式的UA079026根据溶解方法进行复溶。

1.3 用细胞培养基制备足够体积的 4X待测抗体工作溶液（受试浓度的四倍，受试浓度根据前期流式条件摸索）。例如：2μg/ml可能是抗体的良好起始测试浓度，因此 4X工作溶液为 8μg/ml。

1.4用细胞培养基制备足够体积的4X UA079026工作溶液。待测抗体与UA079026 摩尔比 1:2。

1.5将4X待测抗体工作溶液和4X UA079026工作溶液按 1:1 的体积比混合。室温避光孵育15min- 1h，得到 Ab- UA079026 复合物2X工作液。

2. Ab-UA079026复合物与细胞孵育

2.1细胞处理：收集、洗涤细胞，使用完全培养基调整细胞浓度，悬浮细胞 1-2×105 cells/mL 的浓度，贴壁细胞 0.5-1×105cells/mL 的浓度，96 孔板每孔加入 100μL 细胞悬液。

2.2 孵育：每孔加入 100μL Ab- UA079026 复合物 2X 工作液，37℃ 5% CO2 培养箱中培养。

3. 流式检测

培养 18-24h 后 (可根据抗体实际内吞时间调整） ，收集细胞进行流式检测抗体的内吞效果，使用Cy5通道检测

 

Fig1. The fluorescent intensity from antibody-probe protein complex internalization into cell is specific for B7-H3 on Hela cell.

pH-sensitive lgG labeling reagents (Deep Red)_UA079026_优爱(UA BIOSCIENCE)官网

 

 

pH-sensitive lgG labeling reagents (Red)以优爱生物UA070127 举例

 

UA070127 与抗体孵育

 

1.1 使用去离子水，将冻干粉形式的UA070127根据溶解方法进行复溶。

1.2 用细胞培养基制备足够体积的 4X待测抗体工作溶液（受试浓度的四倍，受试浓度根据前期流式条件摸索）。例如：2μg/ml可能是抗体的良好起始测试浓度，因此 4X工作溶液为 8μg/ml。

1.3 用细胞培养基制备足够体积的4X UA070127 工作溶液。待测抗体与UA070127 摩尔比 1:2。

1.4 将4X待测抗体工作溶液和4X UA070127 工作溶液按 1:1 的体积比混合。室温避光孵育 15min- 1h，得到 Ab- UA070127 复合物2X工作液。

2. Ab- UA070127 复合物与细胞孵育

2.1细胞处理：收集、洗涤细胞，使用完全培养基调整细胞浓度，悬浮细胞 1-2×10^5 cells/mL 的浓度，贴壁细胞 0.5-1×10^5cells/mL 的浓度，96 孔板每孔加入 100μL 细胞悬液。

 

2.2 孵育：每孔加入 100μL Ab- UA070127 复合物 2X 工作液，37℃ 5% CO2 培养箱中培养。

3. 流式检测
培养 18-24h 后 (可根据抗体实际内吞时间调整） ，收集细胞进行流式检测抗体的内吞效果，使用PE通道检测

 

Fig1. The fluorescent intensity from antibody-probe protein complex internalization into cell is specific for B7-H3 on Hela cell.

pH-sensitive lgG labeling reagents (Red)_UA070127_优爱(UA BIOSCIENCE)官网

 

 

 

 

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