靶向Bromodomain非催化保守残基的活性探针设计及其在表观遗传研究试剂盒中的应用

摘要

Bromodomain（BRD）家族蛋白作为识别组蛋白乙酰化赖氨酸（KAc）的关键表观遗传"阅读器"，在癌症等疾病中扮演重要调控角色，是极具潜力的治疗靶点。然而，由于多数BRD缺乏经典催化活性且其配体结合口袋内缺乏易反应的氨基酸残基，开发能够直接捕获并分析其活性的化学探针面临巨大挑战。本研究基于广谱BRD抑制剂BSP的结构，创新性地设计出可共价标记BRD高度保守残基的活性探针，并通过质谱与晶体学方法系统验证了其标记特异性与结合模式。该探针的成功开发，为构建用于表观遗传机制研究与药物发现的Epigeneous Bromodomain 研究试剂盒奠定了核心技术基础。

一、 靶点特性与探针设计挑战

BRD蛋白主要通过其保守的KAc识别口袋参与基因转录调控。设计针对此类蛋白的活性探针面临双重障碍：1）其功能依赖于底物识别而非催化过程，传统基于酶活性的探针设计策略不适用；2）结合口袋内的氨基酸残基通常不具备高反应性，难以实现特异性共价标记。因此，亟需一种能够直接、共价地"捕获"BRD蛋白，并反映其与小分子配体结合特性的新型探针工具。

二、 活性探针BTZ的设计与验证

2.1 设计思路与分子构建
本研究以具有广谱BRD抑制活性的化合物BSP为结构起点。通过序列比对与分子对接分析，发现BSP的甲基磺酰胺基团指向BRD结合口袋内一个高度保守的赖氨酸（Lys）残基。基于赖氨酸的亲核特性，研究团队选择已知可选择性标记赖氨酸的二氯三嗪作为亲电弹头，将其与BSP的核心骨架连接，合成了新型活性探针BTZ。

2.2 体外标记活性的质谱验证
将BTZ探针与多种重组BRD蛋白孵育后，利用质谱分析成功检测到共价标记的蛋白产物。定量分析表明，BTZ探针针对不同BRD家族成员的标记效率，与其母体抑制剂BSP的抑制活性趋势高度一致，证实了该探针能够准确反映配体-蛋白相互作用的生物学特性。

三、 结合位点的精准鉴定与意外发现

3.1 对BRD4(1)与BRD3(2)的特异性标记
通过二级质谱分析，研究团队在BRD4(1)和BRD3(2)中成功鉴定到被BTZ探针共价修饰的特异性赖氨酸残基，其位置与分子对接预测完全吻合。

3.2 BRD9中的独特2:1结合模式
在BRD9中，其KAc结合口袋附近缺乏可修饰的赖氨酸，但BTZ探针却显示出高达77%的修饰率。晶体结构解析揭示了一个独特的分子间互锁结构：一个BTZ探针分子同时与两个BRD9蛋白单体结合。其中一个结合模式为传统的非共价占据活性口袋，另一个则通过共价键连接到活性口袋外的酪氨酸（Tyr106）残基上。这种2:1的化学计量比与先前报道的BRD9功能性二聚体一致。动力学实验进一步证实，BTZ探针与酪氨酸残基的结合亲和力优于赖氨酸，这拓展了探针的应用范围。

四、 在复杂生物体系中的应用与试剂盒开发潜力

4.1 功能化衍生与检测
研究证实，被BTZ探针共价标记的重组BRD4(1)蛋白，可顺利通过铜催化的点击化学反应，连接上荧光染料或生物素标签。随后通过SDS-PAGE、Western Blot进行可视化检测，证明了探针在功能化修饰与检测方面的兼容性。

4.2 细胞裂解液中的靶点垂钓
将BTZ探针应用于K562和THP-1细胞的全蛋白裂解液中进行下拉实验，结合质谱鉴定，成功捕获并鉴定出包括BRD4、BRD8、SMARCA4、SUPT16H在内的多种含有BRD结构域的蛋白。这充分证明了BTZ探针在复杂生物样品中特异性识别和富集BRD蛋白家族的能力。

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