5-乙炔基尿苷：一种具有生物正交标记潜力的mRNA治疗用核苷类似物

一、EU修饰mRNA的表达特性与机制分析

为评估EU修饰对mRNA功能的影响，研究合成了全部尿苷被EU、Ψ、m1Ψ或未修饰尿苷（U）取代的编码黄色荧光蛋白（YFP）的mRNA。在人源巨噬细胞中通过电穿孔转染后，流式细胞术检测显示，EU修饰mRNA的YFP蛋白表达水平显著低于其他组别（m1Ψ > U > Ψ > EU）。然而，该表达水平在观测时间内保持稳定，表明EU修饰并未导致蛋白产物的快速衰减。

进一步的机制探究揭示了表达差异的多因素成因。首先，定量PCR分析显示，细胞内EU修饰mRNA的丰度约为其他修饰形式的十分之一，提示其转染或细胞内稳定性可能存在差异。其次，无细胞体外翻译体系实验结果排除了细胞特异性因素的干扰，证实EU修饰mRNA本身的翻译效率确实最低（约为未修饰mRNA的1/10）。综合表明，EU修饰mRNA较低的蛋白产量是其转染/稳定性与固有翻译效率共同作用的结果。

二、EU修饰mRNA的低免疫原性特征

评估核苷类似物的免疫激活潜能至关重要。研究通过检测关键炎症因子与干扰素刺激基因的表达来评估先天免疫响应。酶联免疫吸附测定显示，转染24小时后，所有修饰mRNA（EU, Ψ, m1Ψ）诱导产生的白细胞介素-6（IL-6）水平均处于低位，其中EU修饰组与未修饰U组存在统计学显著差异，表明其有效的免疫沉默能力。

对干扰素通路下游基因MX1，以及免疫相关基因PKR与TAP2的转录水平分析进一步证实了这一点。未修饰及Ψ修饰mRNA能一定程度诱导MX1表达上调，而EU与m1Ψ修饰mRNA则未引起明显变化。对于PKR与TAP2，EU与m1Ψ修饰同样未显示激活效应，甚至略有抑制。这些数据一致表明，EU修饰与m1Ψ相似，能有效规避由mRNA触发的固有免疫识别通路。

三、EU修饰对mRNA二级结构的影响

为探究观察到的表型是否源于mRNA折叠的改变，研究采用SHAPE-MaP技术分析了不同修饰mRNA的二级结构。结果表明，Ψ与m1Ψ修饰的mRNA结构高度相似，且与未修饰U的mRNA存在显著差异。相比之下，EU修饰mRNA的全局折叠与未修饰U的mRNA最为接近。深入分析显示，Ψ与m1Ψ可能通过增强碱基配对的稳定性来影响结构，而EU对碱基配对的影响相对较弱，其反应性谱与天然尿苷存在差异但不同于Ψ/m1Ψ。这说明，EU、Ψ和m1Ψ虽然都改变了局部化学环境，但引起了不同的结构后果，且EU的表型在很大程度上独立于对天然mRNA整体折叠的重塑。

四、结论与展望

本研究系统表征了5-乙炔基尿苷（EU）作为mRNA中尿苷替代物的特性。核心发现包括：

1. 低免疫原性：EU修饰能有效避免巨噬细胞的先天免疫激活，效果与目前广泛应用的m1Ψ相当。
2. 独特的表达与折叠特性：EU修饰导致mRNA的转染/稳定性和翻译效率降低，但其蛋白表达稳定。其修饰的mRNA二级结构更接近天然形态，这与Ψ/m1Ψ明显不同。
3. 生物正交标记潜力：EU携带的炔基为其关键优势，可通过点击化学反应实现mRNA的特异性标记与追踪，这在成像、定位或亲和纯化等应用中具有重要价值。

综上所述，5-乙炔基尿苷不仅是一种有效的免疫沉默修饰，其独特的化学与结构特性，特别是为生物正交标记提供的化学手柄，使其在基础研究及下一代mRNA治疗与疫苗的精细化开发中具有广阔的应用前景。

五、提供labeling EU的厂商有哪些？

南京优爱蛋白自主研发的 Protein labeling EU（5-乙炔基尿苷）（货号：UA086024），是一款基于5-乙炔基尿苷（EU）点击化学标记技术开发的高效、特异性蛋白标记工具。本产品利用EU作为尿苷类似物，可在RNA合成过程中掺入新生RNA链，再通过点击化学反应与荧光染料或生物素等报告分子高效偶联，实现RNA的标记与可视化，适用于RNA转录与代谢追踪、细胞增殖检测、成像分析及高通量筛选等领域。

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