小鼠Raw264.7与BMMs破骨分化：原理与应用指南

破骨细胞（Osteoclasts, OCs）是骨组织中唯一具有骨吸收功能的多核巨细胞，其分化与功能异常与骨质疏松、类风湿性关节炎、骨肿瘤等多种疾病密切相关。建立稳定、高效的破骨细胞体外诱导分化模型是骨代谢研究的基础。

本文系统介绍了基于RANKL/M-CSF信号轴的两种经典破骨细胞诱导体系——RAW264.7细胞系诱导体系与原代骨髓单核细胞（BMMs）诱导体系，并重点介绍优爱生物（UA BIOSCIENCE）开发的配套细胞因子套装在两种模型中的应用方案，为骨生物学研究提供实验参考。

 

一. 破骨细胞分化的分子机制

 

破骨细胞来源于造血干细胞的单核-巨噬细胞谱系，其分化成熟受多种细胞因子精密调控。其中，巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）是破骨细胞分化最核心的调控因子：

M-CSF：通过与c-Fms受体结合，促进破骨前体细胞的存活、增殖和分化准备

RANKL：与破骨前体细胞表面的RANK受体结合，激活NF-κB、MAPK、PI3K/Akt等信号通路，驱动破骨细胞特异性基因（如NFATc1、TRAP、CTSK、MMP9等）表达，促进细胞融合形成多核成熟破骨细胞

体外实验中，通过外源性添加重组M-CSF和RANKL蛋白，可在细胞系或原代细胞中高效诱导破骨细胞分化。

 

二. 两种经典破骨细胞诱导体系比较

 

根据起始细胞来源的不同，破骨细胞体外诱导主要分为细胞系模型和原代细胞模型两大类，各有其适用场景和技术特点：

 

比较维度	RAW264.7细胞系模型	原代BMMs模型
细胞来源	小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系	小鼠骨髓原代单核细胞
操作难度	简单，无需分离原代细胞	较复杂，需骨髓冲洗和裂红处理
细胞均一性	高，细胞状态稳定	受个体差异影响
生物学相关性	适合机制研究	更接近生理状态
诱导效率	高，多核细胞比例大	中等，但功能更成熟
适用研究	药物筛选、信号通路研究	生理病理机制、药物评价

 

三. RAW264.7细胞系诱导破骨分化方案（UA090049）

 

操作流程：

1.破骨细胞前体细胞接种

1.1 将生长状态良好的Raw 264.7细胞用含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM完全培养基重悬，并进行细胞计数。

1.2 将细胞以2.5 × 10³ cells/mL的密度，接种于已预先放置无菌盖玻片的24孔细胞培养板中，每孔加入1mL细胞悬液。

1.3 将培养板置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中静置培养18小时，使细胞充分贴壁。

2.破骨细胞诱导分化

2.1 细胞贴壁后（接种后约18小时），吸弃孔内旧培养基。

2.2更换为新鲜的破骨细胞诱导完全培养基。诱导培养基为含10% FBS的α-MEM培养基，并补充50 ng/mL重组小鼠M-CSF 蛋白及 100 ng/mL重组小鼠RANK L蛋白。

2.3此后，每3天更换一次诱导培养基。更换时，轻柔吸弃旧液，并加入等体积的、含有相同浓度M-CSF蛋白与RANK L蛋白的新鲜诱导培养基。

3. 细胞形态学观察与鉴定

3.1形态观察：自诱导开始，定期在倒置显微镜下观察细胞形态变化。通常，在RANK L诱导 4天 后，可观察到典型的多核破骨细胞样结构。

3.2 TRAP染色验证：RANK L诱导 5天 后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色以特异性鉴定破骨细胞。严格按照TRAP染色试剂盒的说明书步骤进行染色操作。

染色完成后，在光学显微镜下观察。成熟的破骨细胞胞浆呈红色或红紫色。

RANK L诱导 5天 后，显微镜下可观察到经典的多核破骨细胞结构

RANK L诱导 5天 后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色以特异性鉴定破骨细胞。染色完成后，在光学显微镜下观察，成熟的破骨细胞胞浆呈红色或红紫色。

 

四. 原代骨髓细胞（BMMs）诱导破骨分化方案（UA090055）

 

操作流程：

1.骨髓细胞接种

1.1 将现取的小鼠骨髓细胞裂红后，用含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM完全培养基重悬，并进行细胞计数。

1.2 将细胞密度稀释至2 × 10⁵ cells/mL，并加入M-CSF至终浓度为30ng/mL，细胞接种于已预先放置无菌盖玻片的24孔细胞培养板中，每孔加入1mL细胞悬液。

1.3 将培养板置于37°C、5% CO₂的细胞培养箱中静置培养5天，每2天换一次液（含30ng/mL M-CSF） 。

2.破骨细胞诱导分化

2.1 吸弃孔内旧培养基。阴性孔中加入含30ng/mL M-CSF的完全培养基，阳性孔中加入含30ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANK L蛋白的完全培养基。

2.2此后，每2天更换一次培养基。阴性孔中加入含30ng/mL M-CSF的完全培养基，阳性孔中加入含30ng/mL M-CSF和50 ng/mL RANK L蛋白的完全培养基。

3. 细胞形态学观察与鉴定

3.1形态观察：自诱导开始，定期在倒置显微镜下观察细胞形态变化。通常，在RANK L诱导 4天 后，可观察到破骨细胞样结构。

3.2 TRAP染色验证：RANK L诱导 5-7天 后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色以特异性鉴定破骨细胞。严格按照TRAP染色试剂盒的说明书步骤进行染色操作。

染色完成后，在光学显微镜下观察。成熟的破骨细胞胞浆呈红色或红紫色。

RANK L诱导 6天 后，显微镜下的破骨细胞。

RANK L诱导 6天 后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色以特异性鉴定破骨细胞。染色完成后，在光学显微镜下观察，成熟的破骨细胞胞浆呈红色或红紫色。

 

实验成功的关键控制点

 

要获得理想的诱导结果，除了严格按照说明书操作外，还需关注以下几个决定成败的细节：

细胞状态是基石。对于Raw264.7细胞，应使用低传代次数、对数生长期、状态饱满的细胞，传代时避免过度消化。

对于BMMs，无菌、快速、高效地分离小鼠股骨和胫骨中的骨髓细胞至关重要，并需彻底裂解红细胞以减少干扰。

试剂与操作的质量控制。重组细胞因子冻干粉溶解时，需使用无菌超纯水，并轻柔吹打混匀，避免反复冻融，建议分装保存。

在诱导过程中，换液动作需轻柔，避免将贴壁不牢的细胞（尤其是早期BMMs）吸走。全程使用经过验证的优质胎牛血清。

表型鉴定的金标准。显微镜下的多核形态是初步判断，TRAP染色是鉴定成熟破骨细胞不可替代的特异性方法。

染色后，成熟的破骨细胞胞浆应呈现鲜明的红色或红紫色，且细胞核不被染色。

 

五. 应用场景与研究展望

 

研究领域	推荐模型	应用示例
破骨分化机制研究	BMMs模型	转录因子、信号通路调控研究
抗骨质疏松药物筛选	RAW264.7模型	高通量筛选破骨分化抑制剂
天然产物活性评价	双模型验证	中药单体抗骨吸收活性研究
骨免疫微环境研究	BMMs模型	炎症因子对破骨分化影响
基因功能研究	RAW264.7模型	基因敲除/过表达效应分析

 

技术发展趋势

随着类器官技术和微流控技术的发展，破骨细胞体外模型正朝着三维培养、多细胞共培养（与成骨细胞、免疫细胞）、高通量自动化方向发展。UA BIOSCIENCE细胞因子套装的高活性和稳定性，为这些先进模型的建立提供了可靠的基础试剂保障。